Abstract Membrane contact sites are molecular bridges between organelles that are sustained by tethering proteins and enable organelle communication. The endoplasmic reticulum (ER) membrane harbors many distinct families of tether proteins that enable the formation of contacts with all other organelles. One such example is the LAM ( L ipid transfer protein A t M embrane contact sites) family, composed of six members, each containing a lipid binding and transfer domain and an ER-embedded transmembrane segment. The family is divided into three homologous pairs each unique in their molecular architecture and localization to different ER subdomains. However, what determines the distinct localization of the different LAMs and which specific roles they carry out in each contact are still open questions. To address these, we utilized a labeling approach to profile the proximal protein landscape of the entire family. Focusing on unique interactors we could support that Lam5 resides at the ER-mitochondria contact site and demonstrate a role for it in sustaining mitochondrial activity. Capturing shared interactors of multiple LAMs, we show how the Lam1/3 and Lam2/4 paralogous pairs could be associated specifically with the plasma membrane. Overall, our work provides new insights into the regulation and function of the LAM family members. More globally it demonstrates how proximity labeling can help identify the shared or unique functions of paralogous proteins.

Abstract The Endoplasmic Reticulum (ER) is the entry site to the secretory pathway, serving as the targeting destination for ∼30% of the proteome. The mechanisms for targeting soluble or integral membrane secretory pathway proteins are well-studied. However, it is currently unknown how the tens of ER surface proteins (SuPs), central for organelle function, reach the outer leaflet of the membrane. It was previously shown that an amphipathic helix (AH) from the Brome mosaic virus protein 1a, is both necessary and sufficient for targeting to the ER surface in baker’s yeast. We therefore utilized this helix as a model substrate and performed a high-content screen to uncover factors that affect SuP targeting. Our results suggest a role for membrane lipid composition in targeting specificity. To see if the presence of an AH is a more general mechanism for SuP targeting, we searched for their presence within SuPs of both yeast and humans. Five endogenous yeast SuPs contained AHs, and of these four were sufficient for ER localization. Moreover, the presence of an AH was conserved to human SuP orthologs. By altering helix features we determine the parameters that affect this new targeting motif. Hence our work demonstrates how specific properties of AHs encode affinity for the ER membrane. More globally, understanding how SuPs are targeted correctly takes us a step forward in determining the underlying mechanisms of cellular localization and secretory pathway functions. The authors declare that they have no conflict of interest.