From Blight to Powdery Mildew Pathogenic effects of microbes on plants have widespread consequences. Witness, for example, the cultural upheavals driven by potato blight in the 1800s. A variety of microbial pathogens continue to afflict crop plants today, driving both loss of yield and incurring the increased costs of control mechanisms. Now, four reports analyze microbial genomes in order to understand better how plant pathogens function (see the Perspective by Dodds ). Raffaele et al. (p. 1540 ) describe how the genome of the potato blight pathogen accommodates transfer to different hosts. Spanu et al. (p. 1543 ) analyze what it takes to be an obligate biotroph in barley powdery mildew, and Baxter et al. (p. 1549 ) ask a similar question for a natural pathogen of Arabidopsis . Schirawski et al. (p. 1546 ) compared genomes of maize pathogens to identify virulence determinants. Better knowledge of what in a genome makes a pathogen efficient and deadly is likely to be useful for improving agricultural crop management and breeding.

Thomas Wicker and colleagues report the whole-genome sequencing of four wheat powdery mildew (Blumeria graminis forma specialis tritici) isolates from different geographic regions. Their comparative genomic analysis provides insights into the evolution of powdery mildews, which are obligate biotropic fungal pathogens. Wheat powdery mildew, Blumeria graminis forma specialis tritici, is a devastating fungal pathogen with a poorly understood evolutionary history. Here we report the draft genome sequence of wheat powdery mildew, the resequencing of three additional isolates from different geographic regions and comparative analyses with the barley powdery mildew genome. Our comparative genomic analyses identified 602 candidate effector genes, with many showing evidence of positive selection. We characterize patterns of genetic diversity and suggest that mildew genomes are mosaics of ancient haplogroups that existed before wheat domestication. The patterns of diversity in modern isolates suggest that there was no pronounced loss of genetic diversity upon formation of the new host bread wheat 10,000 years ago. We conclude that the ready adaptation of B. graminis f.sp. tritici to the new host species was based on a diverse haplotype pool that provided great genetic potential for pathogen variation.

Abstract Background Protein effectors of pathogenicity are instrumental in modulating host immunity and disease resistance. The powdery mildew pathogen of grasses Blumeria graminis causes one of the most important diseases of cereal crops. B. graminis is an obligate biotrophic pathogen and as such has an absolute requirement to suppress or avoid host immunity if it is to survive and cause disease. Results Here we characterise a superfamily predicted to be the full complement of Candidates for Secreted Effector Proteins (CSEPs) in the fungal barley powdery mildew parasite B. graminis f.sp. hordei . The 491 genes encoding these proteins constitute over 7% of this pathogen’s annotated genes and most were grouped into 72 families of up to 59 members. They were predominantly expressed in the intracellular feeding structures called haustoria, and proteins specifically associated with the haustoria were identified by large-scale mass spectrometry-based proteomics. There are two major types of effector families: one comprises shorter proteins (100–150 amino acids), with a high relative expression level in the haustoria and evidence of extensive diversifying selection between paralogs; the second type consists of longer proteins (300–400 amino acids), with lower levels of differential expression and evidence of purifying selection between paralogs. An analysis of the predicted protein structures underscores their overall similarity to known fungal effectors, but also highlights unexpected structural affinities to ribonucleases throughout the entire effector super-family. Candidate effector genes belonging to the same family are loosely clustered in the genome and are associated with repetitive DNA derived from retro-transposons. Conclusions We employed the full complement of genomic, transcriptomic and proteomic analyses as well as structural prediction methods to identify and characterize the members of the CSEPs superfamily in B. graminis f.sp. hordei . Based on relative intron position and the distribution of CSEPs with a ribonuclease-like domain in the phylogenetic tree we hypothesize that the associated genes originated from an ancestral gene, encoding a secreted ribonuclease, duplicated successively by repetitive DNA-driven processes and diversified during the evolution of the grass and cereal powdery mildew lineage.

Abstract The establishment of host-microbe interactions requires molecular communication between both partners, which involves the mutual transfer of noncoding small RNAs. Previous evidence suggests that this is also true for the barley powdery mildew disease, which is caused by the fungal pathogen Blumeria hordei . However, previous studies lacked spatial resolution regarding the accumulation of small RNAs upon host infection by B. hordei . Here, we analysed site-specific small RNA repertoires in the context of the barley- B. hordei interaction. To this end, we dissected infected leaves into separate fractions representing different sites that are key to the pathogenic process: epiphytic fungal mycelium, infected plant epidermis, isolated haustoria, a vesicle-enriched fraction from infected epidermis, and extracellular vesicles. Unexpectedly, we discovered enrichment of specific 31- to 33-base long 5’-terminal fragments of barley 5.8S ribosomal RNA (rRNA) in extracellular vesicles and infected epidermis, as well as particular B. hordei tRNA fragments in haustoria. We describe canonical small RNAs from both the plant host and the fungal pathogen that may confer cross-kingdom RNA interference activity. Interestingly, we found first evidence of phased small RNAs (phasiRNAs) in B. hordei , a feature usually attributed to plants, which may be associated with the post-transcriptional control of fungal coding genes, pseudogenes, and transposable elements. Our data suggests a key and possibly site-specific role for cross-kingdom RNA interference and noncoding RNA fragments in the host-pathogen communication between B. hordei and its host barley.

Outbreaks of fungal diseases have devastated plants and animals throughout history. Over the past century, the repeated emergence of coffee wilt disease caused by the fungal pathogen Fusarium xylarioides severely impacted coffee production across sub-Saharan Africa. To improve the disease management of such pathogens, it is crucial to understand their genetic structure and evolutionary potential. We compared the genomes of 13 historic strains spanning 6 decades and multiple disease outbreaks to investigate population structure and host specialisation. We found that F . xylarioides comprised at least 4 distinct lineages: 1 host-specific to Coffea arabica , 1 to C . canephora var. robusta, and 2 historic lineages isolated from various Coffea species. The presence/absence of large genomic regions across populations, the higher genetic similarities of these regions between species than expected based on genome-wide divergence and their locations in different loci in genomes across populations showed that horizontal transfers of effector genes from members of the F . oxysporum species complex contributed to host specificity. Multiple transfers into F . xylarioides populations matched different parts of the F . oxysporum mobile pathogenicity chromosome and were enriched in effector genes and transposons. Effector genes in this region and other carbohydrate-active enzymes important in the breakdown of plant cell walls were shown by transcriptomics to be highly expressed during infection of C . arabica by the fungal arabica strains. Widespread sharing of specific transposons between F . xylarioides and F . oxysporum , and the correspondence of a putative horizontally transferred regions to a Starship (large mobile element involved in horizontal gene transfers in fungi), reinforce the inference of horizontal transfers and suggest that mobile elements were involved. Our results support the hypothesis that horizontal gene transfers contributed to the repeated emergence of coffee wilt disease.

Abstract Outbreaks of fungal disease have devastated plants and animals throughout history. Over the past century, the repeated emergence of coffee wilt disease caused by the fungal pathogen Fusarium xylarioides severely impacted coffee production across sub-Saharan Africa. To improve the disease management of such pathogens, it is crucial to understand their genetic structure and evolutionary potential. We compared the genomes of 13 historic strains spanning six decades and multiple disease outbreaks to investigate population structure and host specialisation. We found F. xylarioides comprises at least four distinct lineages: one host-specific to Coffea arabica , one to C. canephora var. robusta , and two historic lineages isolated from various Coffea species. Mapping variation onto a new long-read reference genome showed that host-specificity appears to be acquired through horizontal transfer of effector genes from members of the F. oxysporum species complex. This species complex is known to cause wilt disease in over 100 plant species. Multiple transfers into the F. xylarioides populations matched to different parts of the F. oxysporum mobile pathogenicity chromosome and were enriched in effector genes and transposons. Effector genes in this region and other horizontally transferred carbohydrate-active enzymes important in the breakdown of plant cell walls were shown by transcriptomics to be highly expressed during infection of C. arabica by the fungal arabica strains. Widespread sharing of specific transposons between F. xylarioides and F. oxysporum , and the presence of large Starship elements, indicate that transposons were involved in horizontal transfers. Our results support the hypothesis that horizontal gene transfers contributed to the repeated emergence of this fungal disease.

The biotrophic fungal pathogen Blumeria graminis causes the powdery mildew disease of cereals and grasses. Proteins with a predicted ribonuclease (RNase)-like fold (termed RALPHs) comprise the largest set of secreted effector candidates within the B. graminis f. sp. hordei genome. Their exceptional abundance suggests they play crucial functions during pathogenesis. We show that transgenic expression of RALPH CSEP0064/BEC1054 increases susceptibility to infection in monocotyledenous and dicotyledonous plants. CSEP0064/BEC1054 interacts in planta with five host proteins: two translation elongation factors (eEF1α and eEF1γ), two pathogenesis-related proteins (PR5 and PR10) and a glutathione-S-transferase. We present the first crystal structure of a RALPH, CSEP0064/BEC1054, demonstrating it has an RNase-like fold. The protein interacts with total RNA and weakly with DNA. Methyl jasmonate levels modulate susceptibility to aniline-induced host RNA fragmentation. In planta expression of CSEP0064/BEC1054 reduces the formation of this RNA fragment. We propose that CSEP0064/BEC1054 is a pseudoenzyme that binds to host ribosomes, thereby inhibiting the action of plant ribosome-inactivating proteins that would otherwise lead to host cell death, an unviable interaction and demise of the fungus.

Abstract The mutual exchange of extracellular vesicles across kingdom borders is a feature of many plant-microbe interactions. The occurrence and cargos of extracellular vesicles has been studied in several instances, but their dynamics in the course of infection have remained elusive. Here we used two different procedures, differential high-speed centrifugation and polymer-based enrichment, to collect extracellular vesicles from the apoplastic wash fluid of barley ( Hordeum vulgare ) leaves challenged by its fungal powdery mildew pathogen, Blumeria hordei . Both methods yielded extracellular vesicles of similar quality and morphological characteristics, though the polymer approach was associated with higher reproducibility. We noted that extracellular vesicles derived from the apoplastic wash fluid constitute polydisperse populations that are selectively responsive to leaf infection by B. hordei . Extracellular vesicles of ∼100 nm – 300 nm diameter became progressively more abundant, in particular from 72 hours post inoculation onwards, resulting in a major peak late during fungal infection. Vesicles of ∼300 nm – 500 nm showed similar accumulation dynamics but reached much lower levels, suggesting they might constitute a separate population. Proteome analysis uncovered an enrichment of biotic stress response proteins associated with the extracellular vesicles. The barley t-SNARE protein Ror2, the ortholog of the PEN1 marker protein of extracellular vesicles in Arabidopsis thaliana , accumulates in extracellular vesicles during powdery mildew infection, hence also qualifying as a potential marker protein. Our study serves as a starting point for investigating the role of extracellular vesicles at different stages of plant-microbe interactions.