Fine-tuned manipulation of tumor tension and vasculature enhances response to chemotherapy and impairs metastatic spread in pancreatic cancer.

ABSTRACT To assess the transcriptomic profile of disease-specific cell populations, fibroblasts from patients with primary open-angle glaucoma (POAG) were reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) before being differentiated into retinal organoids and compared to those from healthy individuals. We performed single-cell RNA-sequencing of a total of 330,569 cells and identified cluster-specific molecular signatures. Comparing the gene expression profile between cases and controls, we identified novel genetic associations for this blinding disease. Expression quantitative trait mapping identified a total of 2,235 significant loci across all cell types, 58 of which are specific to the retinal ganglion cell subpopulations, which ultimately degenerate in POAG. Transcriptome-wide association analysis identified genes at loci previously associated with POAG, and analysis, conditional on disease status, implicated 54 statistically significant retinal ganglion cell-specific expression quantitative trait loci. This work highlights the power of large-scale iPSC studies to uncover context-specific profiles for a genetically complex disease.

Abstract We previously used a pulse-based in vitro assay to unveil targetable signalling pathways associated with innate cisplatin resistance in lung adenocarcinoma (Hastings et al., 2020). Here we advanced this model system and identified a non- genetic mechanism of resistance that drives recovery and regrowth in a subset of cells. Using RNAseq and a suite of biosensors to track single cell fates both in vitro and in vivo, we identified that early S phase cells have a greater ability to maintain proliferative capacity, which correlated with reduced DNA damage over multiple generations. In contrast, cells in G1, late S or those treated with PARP/RAD51 inhibitors, maintained higher levels of DNA damage and underwent prolonged S/G2 phase arrest and senescence. Combined with our previous work, these data indicate that there is a non-genetic mechanism of resistance in lung adenocarcinoma that is dependent on the cell cycle stage at the time of cisplatin exposure.

Identification of clinically viable strategies for overcoming resistance to platinum chemotherapy in lung adenocarcinoma has been hampered by inappropriately tailored in vitro assays of drug response. Therefore, using a pulse model that closely recapitulates the in vivo pharmacokinetics of platinum therapy, we profiled cisplatin-induced signalling, DNA damage and apoptotic responses across a panel of lung adenocarcinoma cell lines. By coupling this data with real-time, single cell imaging of cell cycle and apoptosis, we show that TP53 mutation status influenced the mode of cisplatin induced cell cycle arrest, but could not predict cisplatin sensitivity. In contrast, P70S6K-mediated signalling promoted resistance by increasing p53/p63 and p21 expression, reducing double-stranded DNA breaks and apoptosis. Targeting P70S6K sensitised both TP53 wildtype and null lines to cisplatin, but not TP53 mutant lines. In summary, using in vitro assays that mimic in vivo pharmacokinetics identified P70S6K as a robust mediator of cisplatin resistance and highlighted the importance of considering somatic mutation status when designing patient-specific combination therapies.

Summary Adult-type diffuse gliomas are a family of aggressive brain tumours with few effective treatments. Their complex cellular makeup adds to the challenge of finding successful therapies. This intratumoural heterogeneity is fuelled by a subpopulation of glioma stem-like cells (GSCs) that drive tumour growth and resistance to standard treatments. Previous research focused on the three glioma types (astrocytoma, oligodendroglioma, glioblastoma) individually revealed malignant cells mimic the transcriptional profiles of normal brain cell types. Whether these diverse cellular states stem from a shared biological origin is unknown. Here, we show through single-cell RNA sequencing of 40 glioma tumours that all gliomas are described by seven recurring cell states. We also identify a shared astrocyte-like GSC population. Our unique method of identifying GSCs, based on reconstructed tumour phylogenies, repositions astrocyte-like cells at the apex of a differentiation hierarchy in glioma. Our findings indicate the transcriptional heterogeneity observed in gliomas stems from a GSC population recapitulating lineages of healthy adult neural stem cells. These results suggest a shared lineage drives the intratumoural heterogeneity observed in adult-type diffuse gliomas. We anticipate that a deeper understanding of the molecular mechanisms maintaining the GSC state will provide a new framework for future therapeutic development and research into glioma cell biology. Highlights Recurring cell states are shared across adult-type diffuse gliomas Reconstructed tumour phylogenies identify an astrocyte-like glioma stem cell population Tumour subclones are segregated non-randomly across cell states

Summary Head and neck cancers, representing the seventh most common malignancy globally, have seen a shift in causative factors from traditional smoking and alcohol use to human papillomavirus (HPV) infection, now accounting for up to 80% of oropharyngeal cancers. We identify the cellular and clonal mechanisms underlying immune avoidance and metastasis by analysing single-cell and spatial genomic data from primary and metastatic cancers. We first map the clonal evolution of malignant cells based on the accumulation of mutations. We identify metastasising clones based on mutational similarity scores between cells in the primary and lymph node metastasis. Genomic analysis of metastasising and non-metastasising clones identified virally mediated protein translation relief ( P =4.24x10 -24 ) pathway underlying metastatic expansion. We show that in metastatic clones, this process is driven through upregulation of transition-initiating factors, EIF4E ( P =1.5x10 -13 ) and EIFG1 ( P <2.22x10 -16 ), and suppression of regulatory kinases EIF4EBP1 ( P =2.1x10), EIF2AK2 ( P <2.22x10 -16 ), and EIF2S1 ( P <2.22x10 -16 ). We subsequently identify that metastatic clones have a corresponding downregulation of the JAK/STAT pathway and immunoproteasome genes PSMB8 ( P <2.22x10 - 16 ) and PSMB9 ( P <2.22x10 -16 ), suggesting these clones escape immune surveillance through decreased INF inflammatory response and antigen presentation. We validate these results using spatial RNA-seq data, where metastatic cancer clones show decreased cell-to-cell interactions with CD4 T-effector memory cells (CD4 TEM ) ( P =0.0077), CD8 T-exhausted cells (CD8Ex) ( P =0.0191), and innate lymphoid cells (ILC) ( P =0.04). Finally, we demonstrate that the upregulation of cap-independent translational drives cell proliferation in metastatic clones through the expression of translation initiation factors ( EIF4G1: P <2.22x10 -16 ). Our results provide evidence of the mechanisms by which virally induced cancer clones lead to advanced disease and poor prognosis in patients.

e14538 Background: Immune checkpoint inhibitors are widely used in oncology. However, immune-related adverse events (iRAEs) are idiosyncratic and can be severe. The overall incidence is 27%, with severe iRAEs occurring in 6% of patients. We hypothesised that distinct immune cell phenotypes (gene expression) correlate with immune-related toxicity from checkpoint inhibitor immunotherapy. Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) is a powerful tool that can assay the gene expression of thousands of individual cells. RPS26 expression mediates CD4/CD8 T cell activation through a known trans-expressive quantitative trait locus at rs1131017 and is linked with autoimmunity. FOS and JUN encode for c-Fos and c-Jun, which dimerise to create the activator protein-1 complex, a well-established transcriptional factor of the immune system. c-Fos is an immunoregulator known to suppress pro-inflammatory cytokines, suggesting that c-FOS deficiency plays a crucial role in developing autoimmunity. We aimed to analyse the transcriptomic differences of peripheral immune cells between patients who experienced severe checkpoint inhibitor therapy iRAE and those who did not. Methods: We identified a pilot cohort of eight patients who developed grade three or above toxicity due to immune checkpoint inhibitors and eight controls who were matched for age, cancer and treatment type. Peripheral blood mononuclear cells were collected prospectively at baseline and two subsequent treatment cycles. Cells were captured on the 10x Chromium platform, and libraries were sequenced to 30,000 reads per cell. Samples were demultiplexed, and the data was analysed with the Seurat package on R statistical software (version 4.3.0). Results: Five patients had baseline samples only, two patients had two samples from two cycles, and one patient had samples from three cycles. After quality control filtering, we identified 36,288 cells from 16 individuals and 24 samples. Immune cells were annotated with the Azimuth package into 29 subtypes. We identified differences in cell proportions of immune cell subsets in the toxicity vs control group, including B naive cells (5.57% vs 3.71% p=0.01) and reduced cytotoxic CD4 T lymphocyte cells (0.66% vs 2.26%, p=0.005). Differential gene expression analysis identified a significantly high expression of ribosomal genes, particularly RPS26, in multiple cell types at baseline (p<0.01) and reduced expression of FOS and JUN-related genes in CD14 and CD16 monocytes, CD4 and CD8 T cells in the toxicity cohort (p<0.01). Conclusions: Overexpression of ribosomal genes and reduced expression of FOS/ JUN genes amongst PBMCs at baseline are potentially predictive biomarkers of severe checkpoint inhibitor immunotherapy toxicity. Validation of these findings in a larger cohort is in progress.

Abstract We present a cohort review of TORS resection for HPV-associated oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC) and its associated oncological outcomes spanning a 10-year period. A retrospective case series review was performed of patients undergoing primary surgical treatment for HPV-associated OPSCC through the St. Vincent’s Head and Neck Cancer service from 2011 to 2022. The primary outcomes were to investigate complete resection of the primary tumour, rates of recurrence, and survival analysis. Secondary outcomes included complications, rates of adjuvant therapy, sites of recurrence and rates of percutaneous endoscopic gastrostomy (PEG). 184 patients underwent TORS-based therapy with neck dissection, and guideline-directed adjuvant therapy for HPV-associated OPSCC. Our median follow-up was 46 months. The positive margin rate on final histopathology analysis was 10.9%. Adjuvant therapy was indicated in 85 patients (46%). The local recurrence rate was 10.9% with the majority (80%) of patients recurring in the first 3 years since treatment. The disease-specific survival at 3 years was 98.6% and at 5 years was 94.4%. The 3-year and 5-year OS for the cohort was 96.7% and 92.5%, respectively. The presence of extranodal extension and positive margins were associated with increased risk of recurrence, whereas adjuvant therapy was found to be a protective factor for both overall recurrence and survival. Major complications occurred in 12 patients (6.5%), resulting in one death. This study has demonstrated that primary surgical therapy for HPV-associated OPSCC is a safe and effective treatment modality with low local recurrence and complication rates, and overall survival benefits.

Primary cilia are crucial for signal transduction in a variety of pathways, including Hedgehog and Wnt. Disruption of primary cilia formation (ciliogenesis) is linked to a number of developmental disorders (known as ciliopathies) and diseases, including cancer. The Ubiquitin-Proteasome System (UPS) component UBR5 was previously identified as a putative modulator of ciliogenesis in a functional genomics screen. UBR5 is an E3 Ubiquitin ligase that is frequently deregulated in tumours, but its biological role in cancer is largely uncharacterised, partly due to a lack of understanding of interacting proteins and pathways. We validated the effect of UBR5 depletion on primary cilia formation using a robust model of ciliogenesis, and identified CSPP1, a centrosomal and ciliary protein required for cilia formation, as a UBR5-interacting protein. We show that UBR5 ubiquitylates CSPP1, and that UBR5 is required for cytoplasmic organization of CSPP1-comprising centriolar satellites in centrosomal periphery. Hence, we have established a key role for UBR5 in ciliogenesis that may have important implications in understanding cancer pathophysiology.