The centriole, and the related basal body, is an ancient organelle characterized by a universal 9-fold radial symmetry and is critical for generating cilia, flagella, and centrosomes. The mechanisms directing centriole formation are incompletely understood and represent a fundamental open question in biology. Here, we demonstrate that the centriolar protein SAS-6 forms rod-shaped homodimers that interact through their N-terminal domains to form oligomers. We establish that such oligomerization is essential for centriole formation in C. elegans and human cells. We further generate a structural model of the related protein Bld12p from C. reinhardtii, in which nine homodimers assemble into a ring from which nine coiled-coil rods radiate outward. Moreover, we demonstrate that recombinant Bld12p self-assembles into structures akin to the central hub of the cartwheel, which serves as a scaffold for centriole formation. Overall, our findings establish a structural basis for the universal 9-fold symmetry of centrioles.

Fundamental to cell adhesion and migration, integrins are large heterodimeric membrane proteins that uniquely mediate inside-out signal transduction, whereby adhesion to the extracellular matrix is activated from within the cell by direct binding of talin to the cytoplasmic tail of the beta integrin subunit. Here, we report the first structure of talin bound to an authentic full-length beta integrin tail. Using biophysical and whole cell measurements, we show that a specific ionic interaction between the talin F3 domain and the membrane-proximal helix of the beta tail disrupts an integrin alpha/beta salt bridge that helps maintain the integrin inactive state. Second, we identify a positively charged surface on the talin F2 domain that precisely orients talin to disrupt the heterodimeric integrin transmembrane (TM) complex. These results show key structural features that explain the ability of talin to mediate inside-out TM signalling.

Kidney failure is frequently observed during and after COVID-19, but it remains elusive whether this is a direct effect of the virus. Here, we report that SARS-CoV-2 directly infects kidney cells and is associated with increased tubule-interstitial kidney fibrosis in patient autopsy samples. To study direct effects of the virus on the kidney independent of systemic effects of COVID-19, we infected human-induced pluripotent stem-cell-derived kidney organoids with SARS-CoV-2. Single-cell RNA sequencing indicated injury and dedifferentiation of infected cells with activation of profibrotic signaling pathways. Importantly, SARS-CoV-2 infection also led to increased collagen 1 protein expression in organoids. A SARS-CoV-2 protease inhibitor was able to ameliorate the infection of kidney cells by SARS-CoV-2. Our results suggest that SARS-CoV-2 can directly infect kidney cells and induce cell injury with subsequent fibrosis. These data could explain both acute kidney injury in COVID-19 patients and the development of chronic kidney disease in long COVID.

Abstract Centrioles are microtubule-based organelles required for the formation of centrosomes and cilia. Centriolar microtubules, unlike their cytosolic counterparts, grow very slowly and are very stable. The complex of centriolar proteins CP110 and CEP97 forms a cap that stabilizes the distal centriole end and prevents its over-elongation. Here, we used in vitro reconstitution assays to show that whereas CEP97 does not interact with microtubules directly, CP110 specifically binds microtubule plus ends, potently blocks their growth and induces microtubule pausing. Cryo-electron tomography indicated that CP110 binds to the luminal side of microtubule plus ends and reduces protofilament peeling. Furthermore, CP110 directly interacts with another centriole biogenesis factor, CPAP/SAS- 4, which tracks growing microtubule plus ends, slows down their growth and prevents catastrophes. CP110 and CPAP synergize in inhibiting plus-end growth, and this synergy depends on their direct binding. Together, our data reveal a molecular mechanism controlling centriolar microtubule plus- end dynamics and centriole biogenesis.

Abstract Following translation of the SARS-CoV-2 RNA genome into two viral polypeptides, the main protease M pro cleaves at eleven sites to release non-structural proteins required for viral replication. M Pro is an attractive target for antiviral therapies to combat the coronavirus-2019 disease (COVID-19). Here, we have used native mass spectrometry (MS) to characterize the functional unit of M pro . Analysis of the monomer-dimer equilibria reveals a dissociation constant of K d = 0.14 ± 0.03 μM, revealing M Pro has a strong preference to dimerize in solution. Developing an MS-based kinetic assay we then characterized substrate turnover rates by following temporal changes in the enzyme-substrate complexes, which are effectively “flash-frozen” as they transition from solution to the gas phase. We screened small molecules, that bind distant from the active site, for their ability to modulate activity. These compounds, including one proposed to disrupt the catalytically active dimer, slow the rate of substrate processing by ~35%. This information was readily obtained and, together with analysis of the x-ray crystal structures of these enzyme-small molecule complexes, provides a starting point for the development of more potent molecules that allosterically regulate M Pro activity.

Abstract Cyclic AMP (cAMP) signalling is crucial for the propagation of asexual malaria blood stage parasites. Recent work on Plasmodium falciparum demonstrated that phosphorylation of the invasion ligand AMA1 by the catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase A (PfPKAc) is an essential step during parasite invasion into red blood cells. However, the exact mechanisms regulating PfPKAc activity are only partially understood and PfPKAc function has not been extensively studied in gametocytes, the sexual blood stage forms that are essential for malaria transmission. By studying a conditional PfPKAc knockdown mutant, we confirm the essential role for PfPKAc in erythrocyte invasion and demonstrate that PfPKAc is involved in regulating gametocyte deformability. Interestingly, we observed that the conditional overexpression of PfPKAc also caused a profound lethal phenotype by preventing intra-erythrocytic parasite multiplication. Whole genome sequencing of parasites selected to tolerate increased PfPKAc expression levels identified missense mutations exclusively in the gene encoding the putative parasite orthologue of 3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1 (PfPDK1). Using targeted mutagenesis, we show that PfPDK1 is essential for PfPKAc activation, most likely by phosphorylating T189 in the PfPKAc activation loop. In summary, our results corroborate the importance of tight regulation of PfPKA signalling for parasite survival and identify PfPDK1 as a crucial upstream regulator in this pathway and potential new drug target.

Abstract Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is the etiological cause of the coronavirus disease 2019, for which no effective therapeutics are available. The SARS-CoV-2 main protease (M pro ) is essential for viral replication and constitutes a promising therapeutic target. Many efforts aimed at deriving effective M pro inhibitors are currently underway, including an international open-science discovery project, codenamed COVID Moonshot. As part of COVID Moonshot, we used saturation transfer difference nuclear magnetic resonance (STD-NMR) spectroscopy to assess the binding of putative M pro ligands to the viral protease, including molecules identified by crystallographic fragment screening and novel compounds designed as M pro inhibitors. In this manner, we aimed to complement enzymatic activity assays of M pro performed by other groups with information on ligand affinity. We have made the M pro STD-NMR data publicly available. Here, we provide detailed information on the NMR protocols used and challenges faced, thereby placing these data into context. Our goal is to assist the interpretation of M pro STD-NMR data, thereby accelerating ongoing drug design efforts.

Abstract Microtubule plus-end tracking proteins (+TIPs) are involved in virtually all microtubule-based cellular processes, and it has been recently proposed that they function as liquid condensates. However, the formation process and internal organization of +TIP condensates are poorly understood. Here, we have investigated the phase separation of the CLIP-170 family member Bik1, a key +TIP implicated in budding yeast cell division. We found that Bik1 is a rod-shaped dimer whose conformation is dominated by its central coiled-coil domain. Liquid condensation is accompanied by Bik1 conformational rearrangements, leading to a 2-3-fold rise in interactions between the protein’s folded and disordered domains. In contrast to classical liquids, the supramolecular structure of the Bik1 condensate is heterogeneous, with a fractal structure of protein-rich and protein-free domains. This observation provides structural evidence in support of recent models of biomolecular condensates based on percolation. More broadly, our results provide insights into the structure, dynamic rearrangement, and organization of a complex, multidomain protein in its dilute and condensed phases. Our experimental framework can be extended to other biomolecular condensates, including more intricate +TIP networks.