The genome of the Southern Ocean phytoplankton Fragilariopsis cylindrus differs markedly from the genomes of its more temperate relatives, with divergent alleles being differentially expressed in environmentally specific conditions such as freezing and darkness. Diatoms are the main primary producers in the Southern Ocean, but how they have adapted to an environment with such extremes of light and temperature has remained unknown. Here Thomas Mock et al. report the genome sequence of a cold-adapted diatom from the Southern Ocean, Fragilariopsis cylindrus, and compare this 'psychrophile' with diatoms that evolved in temperate oceans. They find that its genome contains highly diverged alleles that are differentially expressed across environmental conditions. The Southern Ocean houses a diverse and productive community of organisms1,2. Unicellular eukaryotic diatoms are the main primary producers in this environment, where photosynthesis is limited by low concentrations of dissolved iron and large seasonal fluctuations in light, temperature and the extent of sea ice3,4,5,6,7. How diatoms have adapted to this extreme environment is largely unknown. Here we present insights into the genome evolution of a cold-adapted diatom from the Southern Ocean, Fragilariopsis cylindrus8,9, based on a comparison with temperate diatoms. We find that approximately 24.7 per cent of the diploid F. cylindrus genome consists of genetic loci with alleles that are highly divergent (15.1 megabases of the total genome size of 61.1 megabases). These divergent alleles were differentially expressed across environmental conditions, including darkness, low iron, freezing, elevated temperature and increased CO2. Alleles with the largest ratio of non-synonymous to synonymous nucleotide substitutions also show the most pronounced condition-dependent expression, suggesting a correlation between diversifying selection and allelic differentiation. Divergent alleles may be involved in adaptation to environmental fluctuations in the Southern Ocean.

ABSTRACT For its replication within red blood cells, the malaria parasite is highly dependent on correctly regulated lipid metabolism. Enzymes involved in lipid metabolic processes are therefore potential drug targets. We here provide a functional analysis of the 20 putative phospholipases that are expressed by asexual blood stages of Plasmodium falciparum . We reveal a high level of redundancy among members of this group, but using conditional mislocalization and gene disruption techniques we show that the phosphoinositide-specific phospholipase C (PF3D7_1013500) has a previously unrecognized essential role in intracellular parasite maturation. In addition, we demonstrate that the patatin-like phospholipase PF3D7_1358000 localizes to the mitochondrion. Parasites lacking this enzyme display a severe growth phenotype and defects in mitochondrial morphogenesis and function leading to hypersensitivity towards proguanil and inhibitors of the mitochondrial electron transport chain including atovaquone. This demonstrates that regulated mitochondrial lipid homeostasis is necessary for mitochondrial function and coordinated division during parasite multiplication.

Host iron deficiency is protective against severe malaria as the human malaria parasite Plasmodium falciparum depends on free iron from its host to proliferate. Due to the absence of transferrin, ferritin, ferroportin, and a functional heme oxygenase, the parasite's essential pathways of iron acquisition, storage, export, and detoxification differ from those in humans and may thus be excellent targets for therapeutic development. However, the P. falciparum proteins involved in these processes remain largely unknown. Here, we show that parasites cultured in erythrocytes from an iron-deficient donor displayed significantly reduced growth rates compared to those grown in red blood cells from healthy controls. Sequencing of parasite RNA revealed diminished expression of genes involved in overall metabolism, hemoglobin digestion, and metabolite transport under low-iron versus control conditions. Supplementation with hepcidin, a specific ferroportin inhibitor, resulted in increased free iron levels in erythrocytes, enhanced parasite replication, and transcriptional upregulation of genes responsible for merozoite motility and host cell invasion. Based on endogenous GFP tagging of differentially expressed putative transporter genes followed by confocal live-cell imaging, proliferation assays with knockout and knockdown lines, and protein structure predictions, we identified six proteins that are likely required for ferrous iron transport in P. falciparum. PfE140 may be involved in iron uptake into the parasite cytosol across the plasma membrane and PfMRS3 could mediate import of the metal ion into the mitochondrion. PfVIT may transport excess iron from the cytosol into cytoplasmic vesicles, and PfZIPCO could be implicated in Zn2+ and Fe2+ export from these organelles, while PfNRAMP and PfCRT are likely responsible for Fe2+ efflux from the digestive vacuole. Our results provide new insights into the mechanisms of iron transport in P. falciparum and the parasite's response to iron status alterations in the host. PfE140 and PfCRT are particularly promising candidate targets for novel antimalarial drugs, as these are essential to the parasite and lack human orthologs.

ABSTRACT Merozoite invasion of host red blood cells (RBCs) is essential for survival of the human malaria parasite Plasmodium falciparum . Proteins involved with RBC binding and invasion are secreted from dual-club shaped organelles at the apical tip of the merozoite called the rhoptries. Here we characterise P. falciparum Cytosolically Exposed Rhoptry Leaflet Interacting protein 2 (PfCERLI2), as a rhoptry bulb protein that is essential for merozoite invasion. Phylogenetic analyses show that cerli2 arose through an ancestral gene duplication of cerli1 , a related cytosolically exposed rhoptry bulb protein. We show that PfCERLI2 is essential for blood-stage growth and localises to the cytosolic face of the rhoptry bulb. Inducible knockdown of PfCERLI2 led to an inhibition of merozoite invasion after tight junction formation. PfCERLI2 knockdown was associated with inhibition of rhoptry antigen processing and a significant elongation of the rhoptries, suggesting that the inability of merozoites to invade is caused by aberrant rhoptry function due to PfCERLI2 deficiency. These findings identify PfCERLI2 as a protein that has key roles in rhoptry biology during merozoite invasion.

ABSTRACT The inner membrane complex (IMC) is a defining feature of apicomplexan parasites, which confers stability and shape to the cell, functions as a scaffolding compartment during the formation of daughter cells and plays an important role in motility and invasion during different life cycle stages of these single celled organisms. To explore the IMC proteome of the malaria parasite Plasmodium falciparum we applied a proximity-dependent biotin identification (BioID)-based proteomics approach, using the established IMC marker protein Photosensitized INA-Labelled protein 1 (PhIL1) as bait in asexual blood-stage parasites. Subsequent mass spectrometry-based peptide identification revealed enrichment of twelve known IMC proteins and several uncharacterized candidate proteins. We validated nine of these previously uncharacterized proteins by endogenous GFP-tagging. Six of these represent new IMC proteins, while three proteins have a distinct apical localization that most likely represent structures described as apical annuli in Toxoplasma gondii . Additionally, various Kelch13 interacting candidates were identified, suggesting an association of the Kelch13 compartment and the IMC in schizont and merozoite stages. This work extends the number of validated IMC proteins in the malaria parasite and reveals for the first time the existence of apical annuli proteins in P. falciparum. Additionally, it provides evidence for a spatial association between the Kelch13 compartment and the IMC in late blood-stage parasites.

Abstract Sequestration of Plasmodium falciparum -infected erythrocytes to host endothelium through the parasite-derived Pf EMP1 adhesion proteins is central to the development of malaria pathogenesis. Pf EMP1 proteins have diversified and expanded to encompass many sequence variants conferring each parasite a similar array of human endothelial receptor binding phenotypes. Here, we analyzed RNA-seq profiles of parasites isolated from 32 P. falciparum infected adult travelers returning to Germany. Patients were categorized into either malaria naïve (n=15) or pre-exposed (n=17), and into severe (n=8) or non-severe (n=24) cases. For differential expression analysis of Pf EMP1-encoding var gene transcripts were de novo assembled from RNA-seq data and, in parallel, var expressed sequence tags were analyzed and used to predict the encoded domain composition of the transcripts. Both approaches showed in concordance that severe malaria was associated with Pf EMP1 containing the endothelial protein C receptor (EPCR)-binding CIDRα1 domain, whereas CD36-binding Pf EMP1 was linked to non-severe malaria outcomes. First-time infected adults were more likely to develop severe symptoms and tended to be infected for a longer period. Thus, parasites with more pathogenic Pf EMP1 variants are more common in patients with a naïve immune status and/or adverse inflammatory host responses to first infections favors growth of EPCR-binding parasites.

Proteins of the lipocalin family are known to bind small hydrophobic ligands and are involved in various physiological processes ranging from lipid transport to oxidative stress responses. The genome of the malaria parasite Plasmodium falciparum contains a single protein PF3D7_0925900 with a lipocalin signature. Using crystallography and small-angle X-ray scattering, we show that the protein has a tetrameric structure of typical lipocalin monomers, hence we name it P. falciparum lipocalin ( Pf LCN), the first lipocalin structurally and functionally characterized in a single-celled eukaryote. We show that Pf LCN is expressed in the intraerythrocytic stages of the parasite and localizes to the parasitophorous and food vacuoles. Conditional knockdown of Pf LCN impairs parasite development, which can be rescued by treatment with the radical scavenger Trolox or by temporal inhibition of hemoglobin digestion. This suggests a key function of Pf LCN in counteracting oxidative stress induced cell damage during multiplication of parasites within red blood cells.

ABSTRACT During the symptomatic human blood phase, malaria parasites replicate within red blood cells. Parasite proliferation relies on the uptake of nutrients, such as amino acids, from the host cell and the blood plasma, requiring transport across multiple membranes. Amino acids are delivered to the parasite through the parasite surrounding vacuolar compartment by specialized nutrient-permeable channels of the erythrocyte membrane and the parasitophorous vacuole membrane (PVM). However, further transport of amino acid across the parasite plasma membrane (PPM) is currently not well characterized. In this study, we focused on a family of Apicomplexan amino acid transporters (ApiATs) that comprises five members in Plasmodium falciparum . First, we localized four of the Pf ApiATs at the PPM using endogenous GFP-tagging. Next, we applied reverse genetic approaches to probe into their essentiality during asexual replication and gametocytogenesis. Upon inducible knockdown and targeted gene disruption a reduced asexual parasite proliferation was detected for Pf ApiAT2 and Pf ApiAT4. Functional inactivation of individual Pf ApiATs targeted in this study had no effect on gametocyte development. Our data suggest that individual Pf ApiATs are partially redundant during asexual in vitro proliferation and fully redundant during gametocytogenesis of P. falciparum parasites. IMPORTANCE Malaria parasites live and multiply inside cells. To facilitate their extremely fast intracellular proliferation they hijack and transform their host cells. This also requires the active uptake of nutrients, such as amino acids, from the host cell and the surrounding environment through various membranes that are the consequence of the parasite’s intracellular lifestyle. In this manuscript we focus on a family of putative amino acid transporters termed ApiAT. We show expression and localization of four transporters in the parasite plasma membrane of Plasmodium falciparum -infected erythrocytes that represent one interface of the pathogen to its host cell. We probed into the impact of functional inactivation of individual transporters on parasite growth in asexual and sexual blood stages of P. falciparum and reveal that only two of them show a modest but significant reduction in parasite proliferation but no impact on gametocytogenesis pointing towards redundancy within this transporter family.

Abstract Membrane transport proteins perform crucial roles in cell physiology. The obligate intracellular parasite Plasmodium falciparum , an agent of human malaria, relies on membrane transport proteins for the uptake of nutrients from the host, disposal of metabolic waste, exchange of metabolites between organelles and generation and maintenance of transmembrane electrochemical gradients for its growth and replication within human erythrocytes. Despite their importance for Plasmodium cellular physiology, the functional roles of a number of membrane transport proteins remain unclear, which is particularly true for orphan membrane transporters that have no or limited sequence homology to transporter proteins in other evolutionary lineages. Therefore, in the current study, we applied endogenous tagging, targeted gene disruption, conditional knockdown and knockout approaches to investigate the subcellular localization and essentiality of six membrane transporters during intraerythrocytic development of P. falciparum parasites. They are localized at different subcellular structures – the food vacuole, the apicoplast, and the parasite plasma membrane – and four out of the six membrane transporters are essential during asexual development. Additionally, the plasma membrane resident transporter 1 (PMRT1, PF3D7_1135300), a unique Plasmodium -specific plasma membrane transporter, was shown to be essential for gametocytogenesis and functionally conserved within the genus Plasmodium . Overall, we reveal the importance of four orphan transporters to blood stage P. falciparum development, which have diverse intracellular localizations and putative functions. Importance Plasmodium falciparum -infected erythrocytes possess multiple compartments with designated membranes. Transporter proteins embedded in these membranes do not only facilitate movement of nutrients, metabolites and other molecules between these compartments, but are common therapeutic targets and can also confer antimalarial drug resistance. Orphan membrane transporter in P. falciparum without sequence homology to transporters in other evolutionary lineages and divergent to host transporters may constitute attractive targets for novel intervention approaches. Here, we localized six of these putative transporters at different subcellular compartments and probed into their importance during asexual parasite growth using reverse genetic approaches. In total, only two candidates turned out to be dispensable for the parasite, highlighting four candidates as putative targets for therapeutic interventions. This study reveals the importance of several orphan transporters to blood stage P. falciparum development.