Abstract The NLRP3 inflammasome is a cytosolic protein complex important for the regulation and secretion of inflammatory cytokines including IL-1β and IL-18. Aberrant overactivation of NLRP3 is implicated in numerous inflammatory disorders. However, the activation and regulation of NLRP3 inflammasome signaling remains poorly understood, limiting our ability to develop pharmacologic approaches to target this important inflammatory complex. Here, we developed and implemented a high-throughput screen to identify compounds that inhibit inflammasome assembly and activity. From this screen we identify and profile inflammasome inhibition of 20 new covalent compounds across 9 different chemical scaffolds, as well as many known inflammasome covalent inhibitors. Intriguingly, our results indicate that NLRP3 possesses numerous reactive cysteines on multiple domains whose covalent targeting blocks activation of this inflammatory complex. Specifically, focusing on compound VLX1570, which possesses multiple electrophilic moieties, we demonstrate that this compound allows covalent, intermolecular crosslinking of NLRP3 cysteines to inhibit inflammasome assembly. Our results, along with the recent identification of numerous covalent molecules that inhibit NLRP3 inflammasome activation, suggests that NLRP3 serves as a cellular electrophile sensor important for coordinating inflammatory signaling in response to redox stress. Further, our results support the potential for covalent cysteine modification of NLRP3 for regulating inflammasome activation and activity.

SUMMARY The NLRP3 inflammasome is a cytosolic protein complex that regulates innate immune signaling in response to diverse pathogenic insults through the proteolytic processing and secretion of pro-inflammatory cytokines such as IL-1β. Hyperactivation of NLRP3 inflammasome signaling is implicated in the onset and pathogenesis of numerous diseases, motivating the discovery of new strategies to suppress NLRP3 inflammasome activity. We sought to define the potential for the proteostasis regulator AA147 to inhibit the assembly and activation of the NLRP3 inflammasome. AA147 is a pro-drug that is metabolically converted to a reactive metabolite at the endoplasmic reticulum (ER) membrane to covalently modify ER-localized proteins such as protein disulfide isomerases (PDIs). We show that AA147 inhibits NLRP3 inflammasome activity in monocytes and monocyte-derived macrophages through a mechanism involving impaired assembly of the active inflammasome complex. This inhibition is mediated through AA147-dependent covalent modification of PDIA1. Genetic depletion or treatment with other highly selective PDIA1 inhibitors similarly blocks NLRP3 inflammasome assembly and activation. Our results identify PDIA1 as a potential therapeutic target to mitigate NLRP3 inflammasome-mediated pro-inflammatory signaling implicated in etiologically diverse diseases.

The NLRP3 inflammasome promotes inflammation in disease, yet the full repertoire of mechanisms regulating its activity are not well delineated. Among established regulatory mechanisms, covalent modification of NLRP3 has emerged as a common route for pharmacological inactivation of this protein. Here, we show that inhibition of the glycolytic enzyme PGK1 results in the accumulation of methylglyoxal, a reactive metabolite whose increased levels decrease NLRP3 assembly and inflammatory signaling in cells. We find that methylglyoxal inactivates NLRP3 via a non-enzymatic, covalent crosslinking-based mechanism, promoting inter- and intra-protein MICA posttranslational linkages within NLRP3. This work establishes NLRP3 as capable of sensing a host of electrophilic chemicals, both exogenous small molecules and endogenous reactive metabolites, and suggests a mechanism by which glycolytic flux can moderate the activation status of a central inflammatory signaling pathway.

Summary Crosstalk between metabolism and stress-responsive signaling is essential to maintaining cellular homeostasis. One way this crosstalk is achieved is through the covalent modification of proteins by endogenous, reactive metabolites that regulate the activity of key stress-responsive transcription factors such as NRF2. Several metabolites including methylglyoxal, glyceraldehyde 3-phosphate, fumarate, and itaconate covalently modify sensor cysteines of the NRF2 regulatory protein KEAP1, resulting in stabilization of NRF2 and activation of its cytoprotective transcriptional program. Here, we employed a shRNA-based screen targeting the enzymes of central carbon metabolism to identify additional regulatory nodes bridging metabolic pathways to NRF2 activation. We found that succinic anhydride, increased by genetic depletion of the TCA cycle enzyme succinyl-CoA synthetase or by direct administration, results in N-succinylation of lysine 131 of KEAP1 to activate NRF2 transcriptional signaling. This study identifies KEAP1 as capable of sensing reactive metabolites not only by several cysteine residues but also by a conserved lysine residue, indicating its potential to sense an expanded repertoire of reactive metabolic messengers.