We performed an extensive immunogenomic analysis of more than 10,000 tumors comprising 33 diverse cancer types by utilizing data compiled by TCGA. Across cancer types, we identified six immune subtypes—wound healing, IFN-γ dominant, inflammatory, lymphocyte depleted, immunologically quiet, and TGF-β dominant—characterized by differences in macrophage or lymphocyte signatures, Th1:Th2 cell ratio, extent of intratumoral heterogeneity, aneuploidy, extent of neoantigen load, overall cell proliferation, expression of immunomodulatory genes, and prognosis. Specific driver mutations correlated with lower (CTNNB1, NRAS, or IDH1) or higher (BRAF, TP53, or CASP8) leukocyte levels across all cancers. Multiple control modalities of the intracellular and extracellular networks (transcription, microRNAs, copy number, and epigenetic processes) were involved in tumor-immune cell interactions, both across and within immune subtypes. Our immunogenomics pipeline to characterize these heterogeneous tumors and the resulting data are intended to serve as a resource for future targeted studies to further advance the field.

Systems biology approaches that are based on the genetics of gene expression have been fruitful in identifying genetic regulatory loci related to complex traits. We use microarray and genetic marker data from an F2 mouse intercross to examine the large-scale organization of the gene co-expression network in liver, and annotate several gene modules in terms of 22 physiological traits. We identify chromosomal loci (referred to as module quantitative trait loci, mQTL) that perturb the modules and describe a novel approach that integrates network properties with genetic marker information to model gene/trait relationships. Specifically, using the mQTL and the intramodular connectivity of a body weight–related module, we describe which factors determine the relationship between gene expression profiles and weight. Our approach results in the identification of genetic targets that influence gene modules (pathways) that are related to the clinical phenotypes of interest.

Targeted mutagenesis is an essential tool of reverse genetics that could be used experimentally to investigate basic plant biology or modify crop plants for improvement of important agricultural traits. Although targeted mutagenesis is routine in several model organisms including yeast and mouse, efficient and widely usable methods to generate targeted modifications in plant genes are not currently available. In this study we investigated the efficacy of a targeted-mutagenesis approach based on zinc-finger nucleases (ZFNs). In this procedure, ZFNs are used to generate double-strand breaks at specific genomic sites, and subsequent repair produces mutations at the break site. To determine whether ZFNs can cleave and induce mutations at specific sites within higher plant genomes, we introduced a construct carrying both a ZFN gene, driven by a heat-shock promoter, and its target into the Arabidopsis genome. Induction of ZFN expression by heat shock during seedling development resulted in mutations at the ZFN recognition sequence at frequencies as high as 0.2 mutations per target. Of 106 ZFN-induced mutations characterized, 83 (78%) were simple deletions of 1–52 bp (median of 4 bp), 14 (13%) were simple insertions of 1–4 bp, and 9 (8%) were deletions accompanied by insertions. In 10% of induced individuals, mutants were present in the subsequent generation, thus demonstrating efficient transmission of the ZFN-induced mutations. These data indicate that ZFNs can form the basis of a highly efficient method for targeted mutagenesis of plant genes.

SUMMARY Pluripotent stem cell (PSC)-derived organoids are emerging as novel human-based microphysiological models but display immature phenotypes with limited subsets of endothelial or stromal cells. Here we demonstrate that in vitro manipulation of gene regulatory networks (GRNs) in PSC-derived liver organoids selected either through computational analysis or targeted tissue design can advance tissue maturation in vitro . Through an unbiased comparison with the genetic signature of mature livers, we identify downregulated GRNs in fetal liver organoids compared to adult livers. We demonstrate that overexpression of PROX1 and ATF5 , together with targeted CRISPR-based transcriptional activation of endogenous CYP3A4 , drives maturation in vitro . Single cell analyses reveal hepatobiliary-, endothelial-, and stellate-like cell populations. The engineered organoids demonstrate enhanced vasculogenesis, capture native liver characteristics (e.g. FXR signaling, CYP3A4 activity), and exhibit therapeutic potential in mice. Collectively, our approach provides a genetically guided framework for engineering developmentally advanced multilineage tissues from hiPSCs. HIGHLIGHTS In vitro tissue maturation via genetically encoded molecular programs Computational analysis to identify maturation transcription factors in liver organoids Promoting vascularization of organoids via genetically encoded molecular programs Single cell analysis of parenchymal and non-parenchymal cells Modeling of native liver functions and in vivo therapeutic potential Graphical Abstract

Single-cell transcriptomics has unveiled a vast landscape of cellular heterogeneity in which the cell cycle is a significant component. We trained a high-resolution cell cycle classifier (ccAFv2) using single cell RNA-seq (scRNA-seq) characterized human neural stem cells. The ccAFv2 classifies six cell cycle states (G1, Late G1, S, S/G2, G2/M, and M/Early G1) and a quiescent-like G0 state, and it incorporates a tunable parameter to filter out less certain classifications. The ccAFv2 classifier performed better than or equivalent to other state-of-the-art methods even while classifying more cell cycle states, including G0. We showcased the versatility of ccAFv2 by successfully applying it to classify cells, nuclei, and spatial transcriptomics data in humans and mice, using various normalization methods and gene identifiers. We provide methods to regress the cell cycle expression patterns out of single cell or nuclei data to uncover underlying biological signals. The classifier can be used either as an R package integrated with Seurat (https://github.com/plaisier-lab/ccafv2_R) or a PyPI package integrated with scanpy (https://pypi.org/project/ccAFv2/). We proved that ccAFv2 has enhanced accuracy, flexibility, and adaptability across various experimental conditions, establishing ccAFv2 as a powerful tool for dissecting complex biological systems, unraveling cellular heterogeneity, and deciphering the molecular mechanisms by which proliferation and quiescence affect cellular processes.

Summary In solid tumors, G0-like states are likely critical for maintaining developmental hierarchies and cellular heterogeneity and promoting tumor growth/recurrence, yet little is known about tumor G0 states or regulation of their ingress/egress. To discover G0-like states and their regulators for glioblastoma (GBM), we analyzed G0 populations in an orthotopic model of GBM using single cell RNA-seq and performed a genome-wide CRISPR-Cas9 screen in patient-derived GBM stem-like cells (GSCs) for genes that trap cells in G0 when inhibited. We identify the protein acetyltransferase KAT5 as a key regulator of transcriptional, epigenetic, and proliferative heterogeneity impacting transitions into G0-like states. KAT5 activity suppresses the emergence of non-dividing subpopulations with oligodendrocyte progenitor and radial glial cell characteristics both in vitro and in a human GSC brain tumor model. In primary gliomas, KAT5 activity is dynamic with KAT5 low tumor cells displaying quiescent properties, while KAT5 activity overall increases from low to high grade tumors and is associated with worse patient outcomes.

Summary Somatic mutations occur as random genetic changes in genes through protein-affecting mutations (PAMs), gene fusions, or copy number alterations (CNAs). Mutations of different types can have a similar phenotypic effect (i.e., allelic heterogeneity) and should be integrated into a unified gene mutation profile. We developed OncoMerge to fill this niche of integrating somatic mutations to capture allelic heterogeneity, assign a function to mutations, and overcome known obstacles in cancer genetics. Application of OncoMerge to the TCGA Pan-Cancer Atlas increased the number and frequency of somatically mutated genes and improved the prediction of the somatic mutation role as either activating or loss of function. Using integrated somatic mutation matrices increased the power to infer gene regulatory networks and uncovered the enrichment of switch-like feedback motifs and delay-inducing feed-forward loops. These studies demonstrate that OncoMerge efficiently integrates PAMs, fusions, and CNAs and strengthens downstream analyses linking somatic mutations to cancer phenotypes. Motivation Genes are mutated in tumors through either PAMs, CNAs, or gene fusions, thereby splitting the signal of the somatic mutation effect across these three mutation types. We developed OncoMerge to systematically integrate the three mutation types into a single mutation profile that better captures the impact of somatic mutations on cancer phenotypes. As a tool OncoMerge fills the gap between the sophisticated variant calling pipelines and downstream analyses.

Single cell RNA-seq has emerged as a powerful tool for resolving cellular states associated with normal and maligned developmental processes. Here, we used scRNA-seq to examine the cell cycle states of expanding human neural stem cells (hNSCs). From this data, we created a cell cycle classifier, which, in addition to traditional cell cycle phases, also identifies a putative quiescent-like state in neuroepithelial-derived cell types during mammalian neurogenesis and in gliomas. This state, Neural G0, is enriched for expression of quiescent NSC genes and other neurodevelopmental markers found in non-dividing neural progenitors. For gliomas, Neural G0 cell populations and gene expression is significantly associated with less aggressive tumors and extended patient survival. Genetic screens to identify modulators of Neural G0 revealed that knockout of genes associated with the Hippo/Yap and p53 pathways diminished Neural G0 in vitro , resulting in faster G1 transit, down regulation of quiescence-associated markers, and loss of Neural G0 gene expression. Thus, Neural G0 represents a dynamic quiescent-like state found in neuro-epithelial derived cells and gliomas.

Atherosclerosis, characterized by the buildup of lipid-rich plaque on the vessel wall, is the primary cause of myocardial infarction and ischemic stroke. Recent studies have demonstrated that dysregulation of yes-associated protein 1 (YAP) and transcriptional coactivator with PDZ-binding domain (TAZ) contributes to plaque development, making YAP/TAZ potential therapeutic targets. However, systemic modulation of YAP/TAZ expression or activities risks serious off-target effects, limiting clinical applicability. To address the challenge, this study develops monocyte membrane-coated nanoparticles (MoNP) as a drug delivery vehicle targeting activated endothelium lining the plaque surface and utilizes MoNP to deliver verteporfin (VP), a potent YAP/TAZ inhibitor, for lesion-specific treatment of atherosclerosis. The results reveal that MoNP significantly enhance payload delivery to inflamed endothelial cells (EC) while avoiding phagocytic cells, and preferentially accumulate in atherosclerotic regions. MoNP-mediated delivery of VP substantially reduces YAP/TAZ expression, suppressing inflammatory gene expression and macrophage infiltration in cultured EC and mouse arteries exposed to atherogenic stimuli. Importantly, this lesion-targeted VP nanodrug effectively decreases plaque development in mice without causing noticeable histopathological changes in major organs. Collectively, these findings demonstrate a plaque-targeted and pathway-specific biomimetic nanodrug, potentially leading to safer and more effective treatments for atherosclerosis.

Abstract Many of the regulatory features governing erythrocyte specification, maturation, and associated disorders remain enigmatic. To identify new regulators of erythropoiesis, we performed a functional genomic screen for genes affecting expression of the erythroid marker CD235a/GYPA. Among validating hits were genes coding for the N 6 -methyladenosine (m 6 A) mRNA methyltransferase (MTase) complex, including, METTL14 , METTL3 , and WTAP . We found that m 6 A MTase activity promotes erythroid gene expression programs and lineage specification through selective translation of >200 m 6 A marked mRNAs, including those coding for SETD methyltransferase, ribosome, and polyA RNA binding proteins. Remarkably, loss of m 6 A marks resulted in dramatic loss of H3K4me3 across key erythroid-specific KLF1 transcriptional targets (e.g., Heme biosynthesis genes). Further, each m 6 A MTase subunit and a subset of their mRNAs targets, including BRD7 , CXXC1 , PABPC1 , PABPC4 , STK40 , and TADA2B , were required for erythroid specification. Thus, m 6 A mRNA marks promote the translation of a network of genes required for human erythropoiesis.