Background: The blockade of the androgen receptor (AR) pathway is an effective treatment for prostate cancer (PCa), but many patients progress to metastatic castration-resistant prostate cancer (mCRPC). Therapies for mCRPC include AR inhibitors (ARi), chemotherapy, PARP inhibitors, and radioligands. Checkpoint inhibitor activity is limited to a small subset of MSI-H mCRPC. AR signaling modulates CD8+ T cell function, but its impact on NK cell (NKc) cytotoxicity is unknown. We investigated the effect of ARi on NKc activation, cytokine secretion, expression of inhibitory receptor NKG2A, and killing of PCa cells in vitro. Methods: PCa cell lines (LNCaP, 22Rv1 [ARv7 mutation], DU145[AR-], PC3 [AR-]) were co-cultured with NK-92 cells and treated with ARi (enzalutamide [enza] and darolutamide [daro]) or in combination with anti-NKG2A antibody monalizumab. Immune cell-mediated tumor cell killing assays and multiplexed cytokine profiling were performed. NKc expression of NKG2A and PCa cells expression of HLA-E were investigated by flow cytometry. The AR-negative cell lines (PC3 and DU145) were stably transduced with a functional AR pathway to evaluate the modulation of HLA-E by AR. The activation status of peripheral blood NKc isolated from patients with PCa before and post-initiation of androgen deprivation therapy (ADT) was investigated by flow cytometry. Results: ARi significantly increased immune-mediated NK-92 cell killing of PCa cells independent of their sensitivity to androgen signaling. Cytokine analysis revealed that ARi-induced NKc activation is mediated by IFN-gamma and TRAIL, as confirmed by blocking antibodies. ARi increased NKG2A expression in NK cells. Immune killing of PCa cells was enhanced with the combination of ARi and monalizumab. ARi also increased the expression of HLA-E, the ligand of the inhibitory NKG2A receptor, on PCa cell lines. Using AR-negative cell lines (PC3 and DU145) and stable transduction of AR, we demonstrate that androgen signaling regulates HLA-E expression. HDAC inhibitors (vorinostat and panobinostat) did not alter the androgen-induced expression of HLA-E in PCa cells. Mirroring the results from NK-92 cells, ADT also activated peripheral blood NK cells isolated from patients with metastatic PCa. Conclusions: ARi activates NK cells through upregulating IFN-γ and TRAIL and promotes the killing of PCa cells. This enhanced cytotoxic killing of PCa cells is augmented by monalizumab. ARi upregulates PCa cell9s expression of HLA-E, suggesting a mechanism suppressing the innate immune response against PCa. These results support novel therapeutic strategies for PCa targeting NK activation with the combination of ARi and monalizumab.

Abstract ITGB6, the gene encoding the β6 subunit of integrin αvβ6, is a potent prognostic marker across multiple cancer types. As a major activator of latent TGFβ, αvβ6, and consequently, ITGB6, has considerable therapeutic implications due to the immunosuppressive effect that activated TGFβ has on the tumor microenvironment. The present study identifies ITGB6 as a potent target for inducing an immune-mediated anti-tumor response. ITGB6 is highly upregulated in various squamous cell carcinomas and pancreatic adenocarcinomas, allowing it to disrupt tumor-immune cell signaling, while avoiding the widespread side-effects of systemic TGFβ inhibition. Genetic knockout of ITGB6 in heterotopically injected head and neck squamous cell carcinoma and pancreatic adenocarcinoma cell lines showed markedly reduced tumor progression in immunocompetent mice. Additionally, co-cultures of human squamous cell carcinoma cell lines and human T-cells showed increased T-cell killing upon cancer cell ITGB6 inhibition. Colony formation experiments give further evidence that the reduction in tumor growth observed upon ITGB6 inhibition in vivo is through immunological clearance of cancer cells and not merely through intrinsic factors. Analysis of The Cancer Genome Atlas (TCGA) revealed not only the high prognostic value of ITGB6 on overall survival but also that high ITGB6 expression in patients is often associated with an inferior response to α-PD-1 and α-PD-L1 immune checkpoint blockade. The potent anti-tumor immune response observed both in vitro and in vivo upon ITGB6 inhibition, combined with our analysis of RNA-seq data from immune checkpoint blockade-treated patients, encourages the development of ITGB6 blockade and immunotherapy combination regimes. Further pre-clinical studies will serve to facilitate the translation of our findings into therapeutic clinical trials of combination therapies for treating immunotherapy-resistant cancers. Visual Abstract

KRAS mutations occur in ~40-50% of mCRC and are associated with aggressive disease that is refractory to anti-EGFR therapies. Pancreatic cancer harbors ~90% KRAS driver gene mutation frequency. Small molecules targeting KRAS G12C gained FDA approval for KRAS G12C-mutated NSCLC. ONC212, a fluorinated imipridone with nM anti-cancer activity has preclinical efficacy against pancreatic cancer and other malignancies. MRTX1133, identified as a noncovalent selective KRAS G12D inhibitor that suppresses G12D signaling by binding to the switch II pocket thereby inhibiting protein-protein interactions. We investigated cell viability, drug synergies, pERK suppression and cytokine, chemokine or growth factor alterations following treatment with 5-Fluorouracil (5-FU) or ONC212 plus MRTX1133 in 6 human CRC and 4 human pancreatic cancer cell lines. IC50 sensitivities ranged from 7 to 12 microM for 5-FU, 0.2-0.8 microM for ONC212, and >100 nM to >5,000 nM for MRTX1133 (G12D N=4: LS513 >100, HPAF-II >1,000, SNUC2B >5,000, PANC-1 >5,000). For non-G12D, the range of IC50 for MRTX1133 was >1,000 to >5,000 nM for CRC lines with G12V, G13D, or WT KRAS (N=7). Synergies between MRTX1133 plus 5-FU or ONC212 were observed regardless of KRAS G12D mutation with combination indices of <0.5 indicating strong synergy. Observed synergies were greater with MRTX1133 plus ONC212 compared to MRTX1133 plus 5-FU. pERK was suppressed with mutant but not wild-type KRAS at nM MRTX1133 doses. Immunostimulatory profiles included reduction in IL8/CXCL8, MICA, Angiopoietin 2, VEGF and TNF-alpha and increase in IL-18/IL-1F4 with MRTX treatments and combinations. Our studies reveal preclinical activity of MRTX1133 alone or synergies when combined with 5-FU or ONC212 against mCRC and pancreatic cancer cells regardless of KRAS G12D mutation. The results suggest that KRAS G12V and KRAS G13D should be further considered in clinical trials including combination therapies involving MRTX1133 and 5-FU or ONC212.

e15196 Background: CXCL8, serves as a crucial multifunctional cytokine that plays a significant role in regulating tumor growth, invasion, and migration. Although in some cancers the critical role of CXCL8 in patient prognosis and disease progression is stablished but its role in CRC & PDAC patients is under investigation. High levels of CXCL8 in tumor microenvironment (TME) and association with cancer stem cell survival, immune surveillance escape & metastasis make it an interesting therapeutic target. Both CRC & PDAC are among the deadliest cancers with dismal prognosis. The need for novel therapeutics with a focus on TME is emerging. MRTX1133 was identified as an inhibitor of KRASG12D. ONC212 is a fluorinated imipridone with strong anti-cancer activity in nM range and preclinical efficacy against pancreatic and other malignancies. Here we report the synergistic inhibition of CXCL8 in both KRAS G12D & KRAS G12V cell lines with use of KRAS G12D inhibitor in combination with 5-FU or ONC212. Methods: Different CRC & PDAC cells were treated with MRTX1133 with 5-FU or ONC212 cytokine profiling at 48h time point was done. Human protein atlas was used for protein and RNA data &TCGA data for survival was used. Results: We previously have shown the synergistic inhibition of pERK and cytokine alteration between MRTX1133 KRAS G12D inhibitor with 5FU or ONC212 in both cell lines with KRAS G12D & KRAS G12V mutation (Tajiknia V et al. AACR 2023 annual meeting). In LS513 KRAS G12D CRC cell line, treatment of ONC212, MRTX1133 and combination of both showed a decrease of 52.36%,58.83% and 71.65% respectively in CXCL8 levels compared to control at 48h time point. In HPAF-II KRAS G12V PDAC cell line, treatment of ONC212, MRTX1133 and combination of both resulted in 38.69%, 64.44%, 57% inhibition of CXCL8 levels respectively compared to control. In SW480 KRAS G12V CRC cell line, treatment of ONC212, MRTX1133 and combination of both demonstrated 25.7%,47.3% and 66.5% inhibition in CXCL8 level respectively compared to control at 48h time point. Single treatment of MRTX1133 caused a decline in CXCL8/IL-8 levels by 30% while single treatment of 5-FU showed a 36% decrease, the combination of both resulted in more than 55% decrease compared to control in LS513 KRAS G12D cell line. In SW480 KRAS G12V cell line, combination of 5-FU & MRTX1133 showed 30% inhibition while in Capan-2 PDAC KRAS G12V cells the same combination showed a 48.2% reduction in CXCL8 compared to control at 48h time point. TCGA data for RNA shows low specificity of CXCL8 for cancer type but it is significantly high in CRC and PDAC. Protein concentration in the Pan-cancer cohort shows significant high level of CXCL8 in CRC. Conclusions: Considering the important role of KRAS mutations and CXCL8 in pathogenesis of CRC & PDAC, the effective inhibition of CXCL8 with the use of targeted therapy in combination could enhance treatment response and patient survival.