Abstract Angiogenesis assays based on in vitro capillary-like growth of endothelial cells (EC) are widely used, either to evaluate the effect of anti- and pro-angiogenesis drugs of interest, or to test and compare the functional capacities of various types of EC and progenitor cells. Among the different methods applied to study angiogenesis, the most commonly used is the “Endothelial Tube Formation Assay” (ETFA). In suitable culture conditions, EC form two-dimensional (2D) branched structures that can lead to a meshed pseudo-capillary network. An alternative approach to ETFA is the “Fibrin Bead Assay” (FBA), based on the use of Cytodex 3 microspheres, which promote the growth of 3D capillary-like patterns from coated EC, suitable for high throughput in vitro angiogenesis studies. The analytical evaluation of these two widely used assays still remains challenging in terms of observation method and image analysis. We previously developed the “Angiogenesis Analyzer” for ImageJ (AA), a tool allowing analysis of ETFA-derived images, according to characteristics of the pseudo-capillary networks. In this work, we developed and implemented a new algorithm for AA able to recognize microspheres and to analyze the attached capillary-like structures from the FBA model. Such a method is presented for the first time in fully automated mode and using non-destructive image acquisition. We detailed these two algorithms and used the new AA version to compare both methods ( i.e . ETFA and FBA) in their efficiency, accuracy and statistical relevance to model angiogenesis patterns of Human Umbilical Vein EC (HUVEC). Although the two methods do not assess the same biological step, our data suggest that they display specific and complementary information on the angiogenesis processes analysis.

ABSTRACT Rationale Phosphorylation-dephosphorylation are processes involved in the adhesion of endothelial cells (ECs) to maintain vascular integrity in adults. VE-cadherin is a target for Src-mediated Y 685 phosphorylation, identified in highly vascularized human glioblastoma where it is involved in the abnormal feature of tumor blood vessels. Objective We aimed at understanding the molecular mechanisms through which Y 685 F-VE-cadherin triggers S1PR1 gene expression and stabilizes lung vessels in adult mice. Methods and Results We compared lung ECs from a knock-in (KI) mouse carrying a point mutation in VE-cadherin (Tyr 685 to Phe) to Wild type. Analysis of EC parameters showed a difference in the migratory rate was between ECs from KI (22.45% ± 5.207) and WT (13.24% ± 5.17) (p-value=0.034). The direct adhesion of ECs from KI mice to fibronectin was significantly higher (37.625 ± 9.23) than that of the WT (26.8 ± 3.258, p-value=0.012). In the fibrin bead assay, ECs from KI showed a weaker angiogenic response. The transcriptome of mutated ECs showed that 884 genes were dysregulated of which 766 genes were downregulated and 118 genes were upregulated. The Gene Ontology Enrichment showed that most of the genes were related to cell-cell adhesion and angiogenesis. Focusing on angiogenic genes, we found that Sphingosine-1-phosphate-receptor was a gene upregulated in mutated ECs which was confirmed by RT-PCR and westernblotting. Mechanistically, chromatin immunoprecipitation assay (CHIPS) demonstrated that FOXF1 directly bound to the S1pr1 promoter 7 fold greater than WT. As a consequence, VE-cadherin at the membrane was higher in the mutant vs WT (100 ± 6.52 for WT vs 189.7 ± 21.06 for KI (p-value 0.0001). Finally, lung morphometric analysis showed less vessels and vascular remodeling with no fibrosis in mutated mice. Conclusions These data extend our knowledge on pY-VE-cadherin mediated pathological angiogenesis and provide new therapeutic opportunities to vascular normalization through pharmacological inhibition of the Y685-VE-cadherin phosphorylation.

Abstract Cancer and inflammation are associated with vascular diseases that affect endothelial cells (ECs) and alter gene expression. We aimed at understanding whether the site Y 685 in the cytoplasmic domain of VE-cadherin triggers epigenetic programming in vivo . Using our knock-in mice carrying the Y 685 F VE-cadherin mutation, RNA sequencing from lung ECs identified 884 differentially expressed genes (DEG) involved in processes such as cell-cell adhesion, vascular development, and angiogenesis. The 30 DEGs include 22 down-regulated genes (genes encoding cell signalling enzymes, anion transport and lipid metabolism) and 8 up-regulated genes, including the endothelial-specific S1PR1. Analysis of the VEGF/VEGFR2 signaling pathway shows a significant decrease in the expression of pY 1173 VEGFR2 whereas VEGF remains constant, this was consistent with impaired migration, proliferation and protrusive properties of ECs in vitro . Co-immunoprecipitation experiments showed that c-Src and Y 685 F-VE-cadherin association which was enhanced in KI compared to WT, resulting in increased in Y 685 F-VE-cadherin phosphorylation at site Y 731 . As a consequence, its partner β-catenin translocates to the nucleus. CHIPS assay showed that FOXF1 binds to the s1pr1 promoter, leading to increased expression of the S1PR1. In vivo, in the lung vasculature, this process was associated with increased vessel wall thickness and reduced fibrosis. Overall, our findings provide a novel transcriptomic profile triggered by Y 685 F-VE-cadherin ECs for potential insights into therapeutic targets to envisage normalisation of the tumor vasculature.