MALDI time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) has become a widely used tool for the classification of biological samples. The complex chemical composition of pollen grains leads to highly specific, fingerprint-like mass spectra, with respect to the pollen species. Beyond the species-specific composition, the variances in pollen chemistry can be hierarchically structured, including the level of different populations, of environmental conditions or different genotypes. We demonstrate here the sensitivity of MALDI-TOF MS regarding the adaption of the chemical composition of three Poaceae (grass) pollen for different populations of parent plants by analyzing the mass spectra with partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) and principal component analysis (PCA). Thereby, variances in species, population and specific growth conditions of the plants were observed simultaneously. In particular, the chemical pattern revealed by the MALDI spectra enabled discrimination of the different populations of one species. Specifically, the role of environmental changes and their effect on the pollen chemistry of three different grass species is discussed. Analysis of the group formation within the respective populations showed a varying influence of plant genotype on the classification, depending on the species, and permits conclusions regarding the respective rigidity or plasticity towards environmental changes.

Abstract Accumulating evidence is suggesting more frequent tropical-to-temperate transitions than previously thought. This raises the possibility that biome transitions could be facilitated by precursor traits. A wealth of ecological, genetic and physiological evidence suggests overlap between drought and frost stress responses, but the origin of this overlap, i.e. the evolution of these responses relative to each other, is poorly known. Here, we test whether adaptation to frost and/or severe winters in grasses (Poaceae) was facilitated by ancestral adaptation to drought. We used occurrence patterns across Köppen-Geiger climate zones to classify species as drought, frost and/or winter tolerant, followed by comparative analyses. Ancestral state reconstructions revealed different evolutionary trajectories in different clades, suggesting both drought-first and frost-first scenarios. A model of correlated evolution was not supported when transition rate heterogeneity was taken into account or compared to traits simulated under independent evolution. Our findings provide some support for ancestral drought tolerance facilitating transitions to cold, temperate biomes, at least in some clades. Different scenarios in different clades is consistent with present-day grasses being either cold or drought specialists, possibly as a consequence of trade-offs between different stress tolerance responses.

Frost tolerance has evolved many times independently across flowering plants. However, conservation of several frost tolerance mechanisms among distant relatives suggests that apparently independent entries into freezing climates may have been facilitated by repeated modification of existing traits (precursor traits). One possible precursor trait for freezing tolerance is drought tolerance, because palaeoclimatic data suggest plants were exposed to drought before frost and several studies have demonstrated shared physiological and genetic responses to drought and frost stress. Here, we combine ecophysiological experiments and comparative analyses to test the hypothesis that drought tolerance acted as a precursor to frost tolerance in cool-season grasses (Pooideae). Contrary to our predictions, we measured the highest levels of frost tolerance in species with the lowest ancestral drought tolerance, suggesting that the two stress responses evolved independently in different lineages. We further show that drought tolerance is more evolutionarily labile than frost tolerance. This could limit our ability to reconstruct the order in which drought and frost responses evolved relative to each other. Further research is needed to determine whether our results are unique to Pooideae or general for flowering plants.

In the past 50 million years climate cooling has triggered the expansion of temperate biomes. During this period, many extant plant lineages in temperate biomes evolved from tropical ancestors and adapted to seasonality and cool conditions. Among the Poaceae (grass family), one of the subfamilies that successfully shifted from tropical to temperate biomes is the Pooideae (temperate grasses). Subfamily Pooideae contains the most important crops cultivated in the temperate regions including wheat (Triticum aestivum) and barley (Hordeum vulgare). Due to the need of well-adapted cultivars, extensive research has produced a large body of knowledge about the mechanisms underlying cold adaptation in cultivated Pooideae species. Especially cold acclimation, a process which increases the frost tolerance during a period of non-freezing cold, plays an important role. Because cold adaptation is largely unexplored in lineages that diverged early in the evolution of the Pooideae, little is known about the evolutionary history of cold acclimation in the Pooideae. Here we test if several species of early diverging lineages exhibit increased frost tolerance after a period of cold acclimation. We further investigate the conservation of five well-studied gene families that are known to be involved in the cold acclimation of Pooideae crop species. Our results indicate that cold acclimation exists in early diverging lineages, but that genes involved in regulation of cold acclimation are not conserved. The investigated gene families show signs of lineage-specific evolution and support the hypothesis that gene family expansion is an important mechanism in adaptive evolution.

Background: Understanding how complex traits evolve through adaptive changes in gene regulation remains a major challenge in evolutionary biology. Over the last ~50 million years, Earth has experienced climate cooling and ancestrally tropical plants have adapted to expanding temperate environments. The grass subfamily Pooideae dominates the grass flora of the temperate regions, but conserved cold-response genes that might have played a role in the cold adaptation to temperate climate remain unidentified. Results: To establish if molecular responses to cold are conserved throughout the Pooideae phylogeny, we assembled the transcriptomes of five species spanning early to later diverging lineages, and compared short- and long-term cold response in orthologous genes based on gene expression data. We confirmed that most genes previously identified as cold responsive in barley also responded to cold in our barley experiment. Interestingly, comparing cold response across the lineages using 8633 high confidence ortholog groups revealed that nearly half of all cold responsive genes were species specific and more closely related species did not share higher numbers of cold responsive genes than more distantly related species. Also, the previously identified cold-responsive barley genes displayed low conservation of cold response across species. Nonetheless, more genes than expected by chance shared cold response, both based on previously studied genes and based on the high confidence ortholog groups. Noticeable, all five species shared short-term cold response in nine general stress genes as well as the ability to down-regulate the photosynthetic machinery during cold temperatures. Conclusions: We observed widespread lineage specific cold response in genes with conserved sequence across the Pooideae phylogeny. This is consistent with phylogenetic dating and historic temperature data which suggest that selection pressure resulting from dramatic global cooling must have acted on already diverged lineages. To what degree lineage specific evolution acted primarily through gain or loss of cold response remains unclear, however, phylogeny-wide conservation of certain genes and processes indicated that the last common ancestor may have possessed some cold response.

Summary Grasses (Poaceae) comprise around 11,800 species and are central for human livelihoods and terrestrial ecosystems. Knowing their relationships and evolutionary history is key to comparative research and crop breeding. Advances in genome-scale sequencing allow for increased breadth and depth of phylogenomic analyses, making it possible to infer a new reference species tree of the family. We inferred a comprehensive species tree of grasses by combining new and published sequences for 331 nuclear genes from genome, transcriptome, target enrichment and shotgun data. Our 1,153-tip tree covers 79% of grass genera (including 21 genera sequenced for the first time) and all but two small tribes. We compared it to a 910-tip plastome tree. The nuclear phylogeny matches that of the plastome at most deep branches, with only a few instances of incongruence. Gene tree–species tree reconciliation suggests that reticulation events occurred repeatedly in the history of grasses. We provide a robust framework for the grass tree of life to support research on grass evolution, including modes of reticulation, and genetic diversity for sustainable agriculture.