Abstract UHRF1 is an essential chromatin protein required for DNA methylation maintenance, mammalian development and gene regulation. We investigated the Tandem-Tudor domain (TTD) of human UHRF1 that is known to bind H3K9me2/3 histones and is a major driver of UHRF1 localization in cells. We verified binding to H3K9me2/3 but unexpectedly discovered stronger binding to H3 peptides and mononucleosomes containing K9me2/3 with additional K4me1. We investigated the combined binding of TTD to H3K4me1-K9me2/3 vs . H3K9me2/3, engineered mutants with specific and differential changes of binding, and discovered a novel read-out mechanism for H3K4me1 in an H3K9me2/3 context that is based on the interaction of R207 with the H3K4me1 methyl group and on counting the H-bond capacity of H3K4. Individual TTD mutants showed up to 10,000-fold preference for the double modified peptides, suggesting that after a conformational change, WT TTD could exhibit similar effects. The frequent appearance of H3K4me1-K9me2 regions demonstrated in our TTD pulldown and ChIP-western blot data suggests that it has specific biological roles. Chromatin pull-down of TTD from HepG2 cells and ChIP-seq data of full-length murine UHRF1 correlate with H3K4me1 profiles indicating that the H3K4me1-K9me2/3 interaction of TTD influences chromatin binding of full-length UHRF1. We demonstrated the H3K4me1-K9me2/3 specific binding of UHRF1-TTD to enhancers and promoters of cell-type specific genes, at the flanks of cell-type specific transcription factor binding sites, and provided evidence supporting an H3K4me1-K9me2/3 dependent and TTD mediated down-regulation of these genes by UHRF1, illustrating the physiological function of UHRF1-TTD binding to H3K4me1-K9me2/3 double marks in a cellular context.

SETDB1 is a major H3K9 methyltransferase involved in heterochromatin formation and silencing of repeat elements. It contains a unique Triple Tudor Domain (3TD) which specifically binds the dual modification of H3K14ac in the presence of H3K9me1/2/3. Here, we explored the role of the 3TD H3-tail interaction for the H3K9 methylation activity of SETDB1. We generated a binding reduced 3TD mutant and demonstrate in biochemical methylation assays on peptides and recombinant nucleosomes containing H3K14ac analogs, that H3K14 acetylation is crucial for the 3TD mediated recruitment of SETDB1. We also observe this effect in cells where SETDB1 binding and activity is globally correlated with H3K14ac, and KO of the H3K14 acetyltransferase HBO1 causes a drastic reduction in H3K9me3 levels at SETDB1 dependent sites. Further analyses revealed that 3TD particularly important at specific target regions like L1M repeat elements, where SETDB1 KO cannot be efficiently reconstituted by the 3TD mutant of SETDB1. In summary, our data demonstrate that the H3K9me3 and H3K14ac are not antagonistic marks but rather the presence of H3K14ac is required for SETDB1 recruitment via 3TD binding to H3K9me1/2/3-K14ac and establishment of H3K9me3.