Abstract Mammalian DNA methylation patterns are established by two de novo DNA methyltransferases DNMT3A and DNMT3B, which exhibit both redundant and distinctive methylation activities. However, the related molecular basis remains undetermined. Through comprehensive structural, enzymology and cellular characterization of DNMT3A and DNMT3B, we here report a multi-layered substrate-recognition mechanism underpinning their divergent genomic methylation activities. A hydrogen bond in the catalytic loop of DNMT3B causes a lower CpG specificity than DNMT3A, while the interplay of target recognition domain and homodimeric interface fine-tunes the distinct target selection between the two enzymes, with Lysine 777 of DNMT3B acting as a unique sensor of the +1 flanking base. The divergent substrate preference between DNMT3A and DNMT3B provides an explanation for site-specific epigenomic alterations seen in ICF syndrome with DNMT3B mutations. Together, this study reveals crucial and distinctive substrate-readout mechanisms of the two DNMT3 enzymes, implicative of their differential roles during development and pathogenesis.

Abstract DNA methylation is an essential epigenetic chromatin modification, and its maintenance in mammals requires the protein UHRF1. It is yet unclear if UHRF1 functions solely by stimulating DNA methylation maintenance by DNMT1, or if it has important additional functions. Using degron alleles, we show that UHRF1 depletion causes a much greater loss of DNA methylation than DNMT1 depletion. This is not caused by passive demethylation as UHRF1-depleted cells proliferate more slowly than DNMT1-depleted cells. Instead, bioinformatics, proteomics and genetics experiments establish that UHRF1, besides activating DNMT1, interacts with DNMT3A and DNMT3B and promotes their activity. In addition, we show that UHRF1 antagonizes active DNA demethylation by TET2. Therefore, UHRF1 has non-canonical roles that contribute importantly to DNA methylation homeostasis; these findings have practical implications for epigenetics in health and disease.

Abstract UHRF1 is an essential chromatin protein required for DNA methylation maintenance, mammalian development and gene regulation. We investigated the Tandem-Tudor domain (TTD) of human UHRF1 that is known to bind H3K9me2/3 histones and is a major driver of UHRF1 localization in cells. We verified binding to H3K9me2/3 but unexpectedly discovered stronger binding to H3 peptides and mononucleosomes containing K9me2/3 with additional K4me1. We investigated the combined binding of TTD to H3K4me1-K9me2/3 vs . H3K9me2/3, engineered mutants with specific and differential changes of binding, and discovered a novel read-out mechanism for H3K4me1 in an H3K9me2/3 context that is based on the interaction of R207 with the H3K4me1 methyl group and on counting the H-bond capacity of H3K4. Individual TTD mutants showed up to 10,000-fold preference for the double modified peptides, suggesting that after a conformational change, WT TTD could exhibit similar effects. The frequent appearance of H3K4me1-K9me2 regions demonstrated in our TTD pulldown and ChIP-western blot data suggests that it has specific biological roles. Chromatin pull-down of TTD from HepG2 cells and ChIP-seq data of full-length murine UHRF1 correlate with H3K4me1 profiles indicating that the H3K4me1-K9me2/3 interaction of TTD influences chromatin binding of full-length UHRF1. We demonstrated the H3K4me1-K9me2/3 specific binding of UHRF1-TTD to enhancers and promoters of cell-type specific genes, at the flanks of cell-type specific transcription factor binding sites, and provided evidence supporting an H3K4me1-K9me2/3 dependent and TTD mediated down-regulation of these genes by UHRF1, illustrating the physiological function of UHRF1-TTD binding to H3K4me1-K9me2/3 double marks in a cellular context.

DNMT3A R882 mutations are frequently observed in AML including the abundant R882H and the rare R882C, R882P and R882S. Using deep enzymology we show here that the DNMT3A-R882H has more than 70-fold altered flanking sequence preferences when compared with wildtype DNMT3A. The R882H flanking sequence preferences mainly differ on the 3' side of the CpG site, where they resemble DNMT3B, while 5' flanking sequence preferences of R882H resemble wildtype DNMT3A, indicating that R882H behaves like a DNMT3A/DNMT3B chimera. Activities and flanking sequence preferences of R882C, R882P and R882S were determined as well. Genomic methylation patterns after expression of wildtype DNMT3A and R882H in human cells reflect the flanking sequence preferences. R882H specific hypermethylation in AML patients are correlated with R882H flanking sequence preferences. The hypermethylation events are accompanied by R882H specific misregulation of several genes with strong cancer connection in AML patients, which are potential downstream targets of R882H.

SETDB1 is a major H3K9 methyltransferase involved in heterochromatin formation and silencing of repeat elements. It contains a unique Triple Tudor Domain (3TD) which specifically binds the dual modification of H3K14ac in the presence of H3K9me1/2/3. Here, we explored the role of the 3TD H3-tail interaction for the H3K9 methylation activity of SETDB1. We generated a binding reduced 3TD mutant and demonstrate in biochemical methylation assays on peptides and recombinant nucleosomes containing H3K14ac analogs, that H3K14 acetylation is crucial for the 3TD mediated recruitment of SETDB1. We also observe this effect in cells where SETDB1 binding and activity is globally correlated with H3K14ac, and KO of the H3K14 acetyltransferase HBO1 causes a drastic reduction in H3K9me3 levels at SETDB1 dependent sites. Further analyses revealed that 3TD particularly important at specific target regions like L1M repeat elements, where SETDB1 KO cannot be efficiently reconstituted by the 3TD mutant of SETDB1. In summary, our data demonstrate that the H3K9me3 and H3K14ac are not antagonistic marks but rather the presence of H3K14ac is required for SETDB1 recruitment via 3TD binding to H3K9me1/2/3-K14ac and establishment of H3K9me3.

Abstract Somatic mutations in protein lysine methyltransferases are frequently observed in cancer cells. We show here that the NSD1 mutations Y1971C, R2017Q and R2017L observed mostly in solid cancers are catalytically inactive suggesting that NSD1 acts as tumor suppressor gene in these tumors. In contrast, the frequent T1150A in NSD2 and its T2029A counterpart in NSD1, both observed in leukemia, are hyperactive and introduce up to H3K36me3 in biochemical and cellular assays, while wildtype NSD2 and NSD1 only generate up to H3K36me2. MD simulations with NSD2 revealed that H3K36me3 formation is possible due to an enlarged active site pocket of T1150A and loss of direct contacts of T1150 to critical residues which regulate the product specificity of NSD2. Bioinformatic analyses of published data suggest that the NSD2 T1150A mutation in lymphocytic leukemia could alter gene regulation by antagonizing H3K27me3 finally leading to the upregulation of oncogenes.