The fusion of three transcriptional activation domains to a nuclease-deficient Cas9 achieves robust induction of gene expression and can induce differentiation of hiPSCs. The RNA-guided nuclease Cas9 can be reengineered as a programmable transcription factor. However, modest levels of gene activation have limited potential applications. We describe an improved transcriptional regulator obtained through the rational design of a tripartite activator, VP64-p65-Rta (VPR), fused to nuclease-null Cas9. We demonstrate its utility in activating endogenous coding and noncoding genes, targeting several genes simultaneously and stimulating neuronal differentiation of human induced pluripotent stem cells (iPSCs).

A comparison of seven dCas9-based transcriptional activators shows that VPR, SAM, and Suntag perform best in cell lines from a variety of organisms. Several programmable transcription factors exist based on the versatile Cas9 protein, yet their relative potency and effectiveness across various cell types and species remain unexplored. Here, we compare Cas9 activator systems and examine their ability to induce robust gene expression in several human, mouse, and fly cell lines. We also explore the potential for improved activation through the combination of the most potent activator systems, and we assess the role of cooperativity in maximizing gene expression.

Significance Using the recently introduced Cas9/sgRNA technique, we have developed a method for specifically targeting Drosophila germ-line cells to generate heritable mutant alleles. We have established transgenic lines that stably express Cas9 in the germ line and compared different promoters and scaffolds of sgRNA in terms of their efficiency of mutagenesis. An overall mutagenesis rate of 74.2% was achieved with this optimized system, as determined by the number of mutant progeny out of all progeny screened. We also evaluated the off-targets associated with the method and established a Web-based resource, as well as a searchable, genome-wide database of predicted sgRNAs appropriate for genome engineering in flies. Our results demonstrate that this optimized Cas9/sgRNA system in Drosophila is efficient, specific, and cost-effective and can be readily applied in a semi-high-throughput manner.

How proteins control the biogenesis of cellular lipid droplets (LDs) is poorly understood. Using Drosophila and human cells, we show here that seipin, an ER protein implicated in LD biology, mediates a discrete step in LD formation—the conversion of small, nascent LDs to larger, mature LDs. Seipin forms discrete and dynamic foci in the ER that interact with nascent LDs to enable their growth. In the absence of seipin, numerous small, nascent LDs accumulate near the ER and most often fail to grow. Those that do grow prematurely acquire lipid synthesis enzymes and undergo expansion, eventually leading to the giant LDs characteristic of seipin deficiency. Our studies identify a discrete step of LD formation, namely the conversion of nascent LDs to mature LDs, and define a molecular role for seipin in this process, most likely by acting at ER-LD contact sites to enable lipid transfer to nascent LDs.

We generated a library of ~1000 Drosophila stocks in which we inserted a construct in the intron of genes allowing expression of GAL4 under control of endogenous promoters while arresting transcription with a polyadenylation signal 3' of the GAL4. This allows numerous applications. First, ~90% of insertions in essential genes cause a severe loss-of-function phenotype, an effective way to mutagenize genes. Interestingly, 12/14 chromosomes engineered through CRISPR do not carry second-site lethal mutations. Second, 26/36 (70%) of lethal insertions tested are rescued with a single UAS-cDNA construct. Third, loss-of-function phenotypes associated with many GAL4 insertions can be reverted by excision with UAS-flippase. Fourth, GAL4 driven UAS-GFP/RFP reports tissue and cell-type specificity of gene expression with high sensitivity. We report the expression of hundreds of genes not previously reported. Finally, inserted cassettes can be replaced with GFP or any DNA. These stocks comprise a powerful resource for assessing gene function.

ABSTRACT Eukaryote-eukaryote endosymbiosis was responsible for the spread of chloroplast (plastid) organelles. Stability is required for the metabolic and genetic integration that drives the establishment of new organelles, yet the mechanisms which act to stabilise nascent endosymbioses – between two fundamentally selfish biological organisms – are unclear. Theory suggests that enforcement mechanisms, which punish misbehaviour, may act to stabilise such interactions by resolving conflict. However, how such mechanisms can emerge in a nascent endosymbiosis has yet to be explored. Here, we propose that endosymbiont-host RNA-RNA interactions, arising from digestion of the endosymbiont population, can result in a cost to host growth for breakdown of the endosymbiosis. Using the model nascent endosymbiosis, Paramecium bursaria – Chlorella spp., we demonstrate that this mechanism is dependent on the host RNA-interference (RNAi) system. We reveal through small RNA (sRNA) sequencing that endosymbiont-derived mRNA released upon endosymbiont digestion can be processed by the host RNAi system into 23-nt sRNA. We predict multiple regions of shared sequence identity between endosymbiont and host mRNA, and demonstrate through delivery of synthetic endosymbiont sRNA that exposure to these regions can knock-down expression of complementary host genes, resulting in a cost to host growth. This process of host gene knock-down in response to endosymbiont-derived RNA processing by host RNAi factors, which we term ‘RNAi-collisions’, represents a mechanism which can promote stability in a nascent eukaryote-eukaryote endosymbiosis. By imposing a cost for breakdown of the endosymbiosis, endosymbiont-host RNA-RNA interactions may drive maintenance of the symbiosis across fluctuating ecological conditions and symbiotic status. SIGNIFICANCE STATEMENT Stable endosymbiosis between eukaryotic microbes has driven the evolution of further cellular complexity. Yet the mechanisms which can act to stabilise a nascent eukaryote-eukaryote endosymbiosis are unclear. Using the model nascent endosymbiotic system, Paramecium bursaria–Chlorella , we demonstrate that endosymbiont-host RNA-RNA interactions can drive a cost to host growth upon endosymbiont digestion, punishing the host for misbehaviour. These RNA-RNA interactions are facilitated by the host RNA-interference system. For endosymbiont mRNA sharing a high-level of sequence identity with host transcripts, this process can result in host gene knock-down. We propose that these endosymbiont-host RNA-RNA interactions–‘RNAi collisions’–represent a viable enforcement mechanism to sanction the host for breakdown of the endosymbiosis, promoting the stability of a nascent endosymbiotic interaction.

Neurofibromatosis type 1 (NF1) is a genetic disorder caused by mutation of the NF1 gene that is associated with various symptoms, including the formation of benign tumors, called neurofibromas, within nerves. Drug treatments are currently limited. The mitogen-activated protein kinase kinase (MEK) inhibitor selumetinib is used for a subset of plexiform neurofibromas (PNs) but is not always effective and can cause side effects. Therefore, there is a clear need to discover new drugs to target NF1-deficient tumor cells. Using a Drosophila cell model of NF1, we performed synthetic lethal screens to identify novel drug targets. We identified 54 gene candidates, which were validated with variable dose analysis as a secondary screen. Pathways associated with five candidates could be targeted using existing drugs. Among these, chloroquine (CQ) and bafilomycin A1, known to target the autophagy pathway, showed the greatest potential for selectively killing NF1-deficient Drosophila cells. When further investigating autophagy-related genes, we found that 14 out of 30 genes tested had a synthetic lethal interaction with NF1. These 14 genes are involved in multiple aspects of the autophagy pathway and can be targeted with additional drugs that mediate the autophagy pathway, although CQ was the most effective. The lethal effect of autophagy inhibitors was conserved in a panel of human NF1-deficient Schwann cell lines, highlighting their translational potential. The effect of CQ was also conserved in a Drosophila NF1 in vivo model and in a xenografted NF1-deficient tumor cell line grown in mice, with CQ treatment resulting in a more significant reduction in tumor growth than selumetinib treatment. Furthermore, combined treatment with CQ and selumetinib resulted in a further reduction in NF1-deficient cell viability. In conclusion, NF1-deficient cells are vulnerable to disruption of the autophagy pathway. This pathway represents a promising target for the treatment of NF1-associated tumors, and we identified CQ as a candidate drug for the treatment of NF1 tumors.

ABSTRACT Endosymbiosis was fundamental for the evolution of eukaryotic complexity. Endosymbiotic interactions can be dissected through forward and reverse-genetic experiments, such as RNA-interference (RNAi). However, distinguishing small (s)RNA pathways in a eukaryote-eukaryote endosymbiotic interaction is challenging. Here, we investigate the repertoire of RNAi pathway protein-encoding genes in the model nascent endosymbiotic system, Paramecium bursaria – Chlorella spp. Using comparative genomics and transcriptomics supported by phylogentics, we identify essential proteome components of the small interfering (si)RNA, scan (scn)RNA, and internal eliminated sequence (ies)RNA pathways. Our analyses reveal that copies of these components have been retained throughout successive whole genome duplication (WGD) events in the Paramecium clade. We then validate feeding-induced siRNA-based RNAi in P. bursaria via knock-down of the splicing factor, u2af1 , which we show to be crucial to host growth. Finally, using simultaneous knock-down paradox controls to rescue the effect u2af1 knock-down, we demonstrate that feeding-induced RNAi in P. bursaria is dependent upon a core pathway of host-encoded Dcr1 , Piwi and Pds1 components. Our experiments confirm the presence of a functional, host-derived RNAi pathway in P. bursaria that generates 23-nt siRNA, validating use of the P. bursaria - Chlorella spp. system to investigate the genetic basis of a nascent endosymbiosis.

ABSTRACT Neurofibromatosis type 1 (NF1) is a genetic disorder associated with various symptoms including the formation of benign tumors along nerves. Drug treatments are currently limited. The MEK inhibitor selumetinib is used for a subset of cases but is not always effective and can cause side effects. Therefore, there is a clear need to discover new drugs to target NF1 -deficient tumor cells. Using a Drosophila cell model of NF1, we performed synthetic lethal screens to identify novel drug targets. We identified 54 candidates, which were validated with variable dose analysis as a secondary screen. Five candidates could be targeted using existing drugs, with autophagy inhibitors (chloroquine (CQ) and bafilomycin A1) showing the greatest potential for selectively killing NF1 -deficient Drosophila cells. When further investigating autophagy-related genes, we found that 14 out of 30 genes tested had a synthetic lethal interaction with NF1 . These 14 genes are involved in the regulation of all aspects of the autophagy pathway and can be targeted with additional autophagy drugs, although none were as effective as CQ. The lethal effect of autophagy inhibitors was conserved in a panel of human NF1 -deficient Schwann cell lines, highlighting their translational potential. The effect of CQ was also conserved in a Drosophila NF1 in vivo model and in a xenografted NF1 -deficient tumor cell line in mice, with CQ treatment resulting in a more significant reduction in tumor growth than selumetinib treatment. Furthermore, combined treatment with CQ and selumetinib resulted in a further reduction in NF1 -deficient cell viability. In conclusion, NF1 -deficient cells are vulnerable to disruption of the autophagy pathway. This pathway represents a promising therapeutic target for NF1 -associated tumors, and CQ was identified as a promising candidate drug for the treatment of NF1 tumors.

Antimicrobial resistance threatens the viability of modern medical interventions. There is a dire need of developing novel approaches to counter resistance mechanisms employed by starved or slow-growing pathogens that are refractory to conventional antimicrobial therapies. Antimicrobial peptides have been advocated as potential therapeutic solutions due to low levels of genetic resistance observed in bacteria against these compounds. However, here we show that subpopulations of stationary phase Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa survive tachyplesin treatment without genetic mutations. These phenotypic variants induce efflux, outer membrane vesicles secretion and membrane modifications in response to tachyplesin exposure, sequestering the peptide in their membranes where it cannot exert its antimicrobial activity. We discovered that formation of these phenotypic variants could be prevented by administering tachyplesin in combination with sertraline, an existing clinically used inhibitor of transmembrane transporters, suggesting a novel approach for combatting antimicrobial-refractory stationary phase bacteria.