Metaproteomics uniquely characterizes host-microbiome interactions. However, most species detected by metagenomics remain hidden to metaproteomics due to sensitivity limits. We present a novel ultra-sensitive metaproteomic solution (uMetaP) that, for the first time, reaches full-length 16S rRNA taxonomic depth and can simultaneously decipher functional features. Querying the mouse gut microbiome, uMetaP achieved unprecedented performance in key metrics like protein groups (47925) alongside taxonomic (220 species) and functional annotations (223 KEGG pathways) - all within 30-min analysis time and with high reproducibility, sensitivity, and quantitative precision. uMetaP revealed previously unidentified proteins of unknown functions, small proteins, and potentially new natural antibiotics. Leveraging the extreme sensitivity of uMetaP and SILAC-labelled bacteria, we revealed the true limit of detection and quantification for the "dark" metaproteome of the mouse gut. Moreover, using a two-bacteria proteome mix, we demonstrated single-bacterium resolution (500 fg) with exceptional quantification precision and accuracy. From deciphering the interplay of billions of microorganisms with the host to exploring microbial heterogeneity, uMetaP represents a quantum leap in metaproteomics. Taken together, uMetaP will open new avenues for our understanding of the microbial world and its connection to health and disease.

ABSTRACT Metaproteomic approach is an attractive way to describe a microbiome at the functional level, allowing the identification and quantification of proteins across a broad dynamic range as well as detection of post-translational modifications. However, it remains relatively underutilized, mainly due to technical challenges that should be addressed, including the complexity in extracting proteins from heterogenous microbial communities. Here, we show that a ChipFilter microfluidic device coupled to LC-MS/MS can successfully be used for identification of microbial proteins. Using cultures of E. coli, B. subtilis and S. cerevisiae , we have shown that it is possible to directly lyse the cells and digest the proteins in the ChipFilter to allow higher number of proteins and peptides identification than standard protocols, even at low cell density. The peptides produced are overall longer after ChipFilter digestion but show no change in their degree of hydrophobicity. Analysis of a more complex mixture of 17 species from the gut microbiome showed that the ChipFilter preparation was able to identify and estimate the amount of 16 of these species. These results show that ChipFilter can be used for the proteomic study of microbiomes, in particular in the case of low volume or low cell density.