Abstract Behavioural analysis based on video recording is becoming increasingly popular within research fields such as; ecology, medicine, ecotoxicology and toxicology. However, the programs available to analyse the data, which are free of cost, user‐friendly, versatile, robust, fast and provide reliable statistics for different organisms (invertebrates, vertebrates and mammals) are significantly limited. We present an automated open‐source executable software ( ToxTrac ) for image‐based tracking that can simultaneously handle several organisms monitored in a laboratory environment. We compare the performance of ToxTrac with current accessible programs on the web. The main advantages of ToxTrac are as follows: (i) no specific knowledge of the geometry of the tracked bodies is needed; (ii) processing speed, ToxTrac can operate at a rate >25 frames per second in HD videos using modern computers; (iii) simultaneous tracking of multiple organisms in multiple arenas; (iv) integrated distortion correction and camera calibration; (v) robust against false positives; (vi) preservation of individual identification; (vii) useful statistics and heat maps in real scale are exported in image, text and excel formats. ToxTrac can be used for high speed tracking of insects, fish, rodents or other species, and provides useful locomotor information in animal behavior experiments. Download ToxTrac here: https://toxtrac.sourceforge.io (Current version v2.61).

Abstract We present a new approach to segment and classify bacterial spore layers from Transmission Electron Microscopy (TEM) images using a hybrid Convolutional Neural Network (CNN) and Random Forest (RF) classifier algorithm. This approach utilizes deep learning, with the CNN extracting features from images, and the RF classifier using those features for classification. The proposed model achieved 73% accuracy, 64% precision, 46% sensitivity, and 47% F1-score with test data. Compared to other classifiers such as AdaBoost, XGBoost, and SVM, our proposed model demonstrates greater robustness and higher generalization ability for non-linear segmentation. Our model is also able to identify spores with a damaged core as verified using TEMs of chemically exposed spores. Therefore, the proposed method will be valuable for identifying and characterizing spore features in TEM images, reducing labor-intensive work as well as human bias.

The ability to cause foodborne illness, anthrax, and other infections has been attributed to numerous lineages within Bacillus cereus sensu lato ( s.l. ). However, existing pathogen surveillance databases facilitate dangerous pathogen misidentifications when applied to B. cereus s.l. , potentially hindering outbreak or bioterrorism attack response efforts. To address this, we developed BTyperDB ( www.btyper.app ), an atlas of B. cereus s.l. genomes with standardized, community-curated metadata. BTyperDB aggregates all publicly available B. cereus s.l. genomes (including >2,600 previously unassembled genomes) with novel genomes donated by laboratories around the world, nearly doubling the number of publicly available B. cereus s.l. genomes. To showcase its utility for pathogen surveillance, we use BTyperDB to identify emerging anthrax toxin- and capsule-harboring lineages. Overall, our study provides insight into the epidemiology of an under-studied group of emerging pathogens and highlights the benefits of inclusive, community-driven metadata FAIRification efforts.

ABSTRACT Spore-forming pathogenic bacteria are adapted for adhering to surfaces, and their endospores can tolerate strong chemicals making decontamination difficult. Understanding the physico-chemical properties of bacteria and spores is therefore essential in developing antiadhesive surfaces and disinfection techniques. However, measuring physico-chemical properties in bulk does not show the heterogeneity between cells. Characterizing bacteria on a single-cell level can provide mechanistic clues usually hidden in bulk measurements. This paper shows how optical tweezers can be applied to characterize single bacteria and spores, and how physico-chemical properties related to adhesion, fluid dynamics, biochemistry, and metabolic activity can be assessed.

Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) are common agents of diarrhea for travelers and a major cause of mortality in children in developing countries. To attach to intestinal cells ETEC express colonization factors, among them CFA/I, which are the most prevalent factors and are the archetypical representative of Class 5 pili. Due to their helical quaternary structure that can be unwound and works as a damper of force, CFA/I pili help ETEC bacteria withstand intestinal fluid motion. We report in this work the CFA/I pilus structure at 4.0 Å resolution and report details of the donor strand complementation. The density map allows us to identify the buried surface area between subunits, and these regions are correlated to quaternary structural stability in class 5 and Chaperone-Usher pili. In addition, from the EM map we also predicted that residue 13 (proline) of the N-terminal β-strand could have a major impact on the filament's structural stability. Therefore, we used optical tweezers to measure and compare the stability of the quaternary structure of wild type CFA/I and point-mutated CFA/I in which proline 13 was changed to a non-polar residue, phenylalanine. We found that pili with this mutated CFA/I require a lower force to unwind, supporting our hypothesis that Pro 13 is important for structural stability. The high-resolution CFA/I pilus structure presented in this work and the analysis of structural stability will be useful for the development of novel antimicrobial drugs that target the pilus structure to reduce its damping properties, which are needed for initial attachment and sustained adhesion of ETEC.

Species within the spore-forming Bacillus cereus sensu lato group are recognized for their role in food spoilage and food poisoning. B. cereus spores are decorated with numerous pilus-like appendages, called S-ENAs and L-ENAs. These appendages are believed to play crucial roles in self-aggregation, adhesion, and biofilm formation. By using both bulk and single-cell approaches, we investigate the role of S- and L-ENAs as well as the impact of different environmental factors in spore-to-spore contacts and in the interaction between spores and vegetative cells. Our findings reveal that ENAs, and particularly their tip fibrilla, play an essential role in spore self-aggregation but not in the adhesion of spores to vegetative cells. The absence of L-BclA, which builds the L-ENA tip fibrillum, reduced both S- and L-ENA mediated spore aggregation, emphasizing the interconnected roles of S- and L-ENAs. Increased salt concentrations in the liquid environment significantly reduced spore aggregation, implying a charge dependency of spore-spore interactions. By elucidating these complex interactions, our study provides valuable insights into spore dynamics. This knowledge can guide future studies on spore behavior in environmental settings and aids in developing strategies to manage bacterial aggregation for beneficial purposes, like controlling biofilms in food production equipment.

Abstract Adhesion pili assembled by the chaperone-usher pathway are superelastic helical filaments on the surface of bacteria, optimized for attachment to target cells. Here, we investigate the biophysical function and structural interactions that stabilize P pili from uropathogenic bacteria. Using optical tweezers we measure P pilus subunit-subunit interaction dynamics and show that pilus compliance is contour-length dependent. Atomic details of subunit-subunit interactions of pili under tension are shown using steered molecular dynamics (sMD) simulations. sMD results also indicate that the N-terminal “staple” region of P pili significantly stabilizes the helical filament structure, consistent with previous structural data, suggesting more layer-to-layer interactions could compensate for the lack of a staple in Type 1 pili. This study informs our understanding of essential structural and dynamic features of adhesion pili, supporting the hypothesis that the biophysical function of pili is niche-adapted rather than a direct consequence of genetic similarity or diversity.

Abstract Bacterial spores are highly resistant to heat, radiation, and various disinfection chemicals. These impacts on the biophysical and physicochemical properties of spores can be studied on the single-cell level using optical tweezers. However, the effect of the trapping laser on spores’ germination rate is not fully understood. In this work, we assess the impact of 1064 nm laser light on the germination of Bacillus thuringiensis spores. The results show that the germination rate of spores after laser exposure follows a sigmoid dose-response relationship, with only 15 % of spores germinating after 20 J of laser light. Under anaerobic growth conditions, the percentage of germinating spores at 20 J increased to 65 %. The results thereby indicate that molecular oxygen is a major contributor to the germination-inhibiting effect observed. Thus, our study highlights the risk for optical trapping of spores and ways to mitigate it.

Abstract Contamination of toxic spore-forming bacteria is problematic since spores can survive a plethora of disinfection chemicals. It is also problematic to rapidly detect if the disinfection chemical was active, leaving spores dead. Robust decontamination strategies, as well as reliable detection methods to identify dead from viable spores, are thus critical. Vibrational detection methods such as Raman spectroscopy has been suggested for rapid diagnostics and differentiation of live and dead spores. We investigate in this work, using laser tweezers Raman spectroscopy, the changes in Raman spectra of Bacillus thuringiensis spores treated with sporicidal agents such as chlorine dioxide, peracetic acid, and sodium hypochlorite. We also imaged treated spores using SEM and TEM to verify if any changes to the spore structure can be correlated to the Raman spectra. We found that chlorine dioxide did not change the Raman spectrum or the spore structure; peracetic acid shows a time-dependent decrease in the characteristic DNA/DPA peaks and ∼20 % of the spores were degraded and collapsed; spores treated with sodium hypochlorite show an abrupt drop in DNA and DPA peaks within 20 minutes all though the spore structure was overall intact, however, the exosporium layer was reduced. Structural changes appeared over several minutes, compared to the inactivation time of the spores, which is less than a minute. We conclude that vibrational spectroscopy provides powerful means to detect changes in spores but it might be problematic to identify if spores are live or dead after a decontamination procedure.

Escherichia coli express adhesion pili that mediate attachment to host cell surfaces that are exposed to body fluids in the urinary and gastrointestinal tracts. Pilin subunits are organized into helical polymers, with a tip adhesin for specific host binding. Pili can elastically unwind when exposed to fluid flow force, reducing the adhesin load, thereby facilitating sustained attachment. Here we investigate biophysical and structural differences of pili commonly expressed on bacteria that inhabit the urinary and intestinal tracts. Optical tweezers measurements reveal that Class 1 pili of uropathogenic E. coli (UPEC), as well as Class 1b of enterotoxigenic E. coli (ETEC), undergo an additional conformational change beyond pilus unwinding, providing significantly more elasticity to their structure than ETEC Class 5 pili. Looking comprehensively at structural and steered molecular dynamics simulation data, we find this difference in Class 1 pili subunit behavior originates from an α -helical motif that can unfold when exposed to force. A disulfide bond cross-linking β -strands in Class 1 pili stabilizes subunits, allowing them to tolerate higher forces than Class 5 pili that lack this covalent bond. We suggest that these extra contributions to pilus resiliency are relevant for the UPEC niche since resident bacteria are exposed to stronger, more transient shear forces compared to those experienced by ETEC bacteria in the mucosa of the intestinal tract. Interestingly, Class 1b ETEC pili include the same structural features seen in UPEC pili, while requiring lower unwinding forces that are more similar to those of Class 5 ETEC pili. Significance Statement Adhesion pili are often essential virulence factors for attachment of pathogenic bacteria in specific environmental niches. We provide mechanistic details of structural differences impacting the biophysical properties of pili found on bacteria in the urinary and intestinal tracts. We see that pili from urinary tract bacteria are composed of subunits optimized for their microenvironment. First, they can tolerate higher forces than intestinal pili due to a disulfide bond that limits subunit unfolding. Second, their greater flexibility is due to an α -helical motif that can unfold, absorbing force that could otherwise lead to bacteria detachment. Our work provides insight into the central role of pilus structural and biophysical properties for the sustained bacterial adherence necessary to initiate disease.