Abstract Rejuvenation, long a quixotic dream, recently became a possibility through exciting new approaches to counteract aging. For example, parabiosis and partial reprogramming through overexpressing four stem cell transcription factors (Yamanaka factors) both rejuvenate organisms and cells 1–5 . We hypothesize there are many other genetic solutions to human cell rejuvenation, and some solutions may be safer and more potent than current gene targets. We set out to develop a systematic approach to identify novel genes that, when overexpressed or repressed, reprogram the global gene expression of a cell back to a younger state. Using the Hayflick model of human cell replicative aging, we performed a Perturb-seq screen of 200 transcription factors (TFs) selected through a combination of bioinformatic analysis and literature search. We identified dozens of potentially rejuvenating TFs—those that when overexpressed or repressed in late passage cells reprogrammed global gene expression patterns back to an earlier passage state. We further validated four top TF perturbations through molecular phenotyping of various aging hallmarks. Late passage cells either overexpressing EZH2 or E2F3 or repressing STAT3 or ZFX had more cell division, less senescence, improved proteostasis, and enhanced mitochondrial function. These TF perturbations led to similar downstream gene expression programs. In addition, the rejuvenating effects of these TFs were independent of telomeres. We believe our general approach for identifying rejuvenating factors can be applied to other model systems, and some of the top TF perturbations we discovered will lead to future research in novel, safer rejuvenation therapies.

Potyviruses possess one positive-sense single-stranded RNA genome mainly with polyprotein processing as their gene expression strategy. The resulting polyproteins are proteolytically processed by three virus-encoded proteases into 11 or 12 mature proteins. One of such, 6-kDa peptide 1 (6K1), is an understudied viral factor. Its function in viral infection remains largely mysterious. This study is to reveal part of its roles by using pepper veinal mottle virus (PVMV) as a model virus. Alanine substitution screening analysis revealed that 15 out of 17 conserved residues across potyviral 6K1 sequences are essential for PVMV infection. However, 6K1 protein is less accumulated in virus-infected cells, even though P3-6K1 junction is efficiently processed by NIa-Pro for its release, indicating that 6K1 undergoes a self-degradation event. Mutating the cleavage site to prevent NIa-Pro processing abolishes viral infection, suggesting that the generation of 6K1 along with its degradation might be important for viral multiplication. We corroborated that cellular autophagy is engaged in 6K1’s degradation. Individual engineering of the 15 6K1 variants into PVMV was performed to allow for their expression along with viral infection. Five of such variants, D30A, V32A, K34A, L36A, and L39A, significantly interfere with viral infection. The five residues are enclosed in a conserved lysine/arginine-rich motif; four of them appear to be crucial in engaging autophagy-mediated self-degradation. Based on these data, we envisaged a scenario that potyviral 6K1s interact with an unknown anti-viral component to be co-degraded by autophagy to promote viral infection.

A total of 164 viruses have been identified in peppers worldwide. To combat viruses, pathogen-derived resistance (PDR) has been employed by expressing a viral genomic segment or a viral protein in host plants. Unfortunately, peppers are recalcitrant to genetic transformation and regeneration. An alternative strategy is to generate PDR in pepper plants by using an attenuated virus-based expression vector. In a previous study on the function of pepper veinal mottle virus (PVMV) 6K1 protein, we mutated a conserved Ala with Arg (A15R), and a second mutation R15G was observed in virus progeny. In this study, we demonstrated that mutating Ala to Gly (A15G) in the 6K1 yield a stable attenuated strain (named PVMV-G-A15G). PVMV-G-A15G can cross-protect pepper plants against a severe strain of PVMV and its close relative, chilli veinal mottle virus. We then engineered PVMV-G-A15G into a viral expression vector that has the Golden Gate cloning feature. To examine if the PVMV vector can be used to mediate PDR, we inserted the complete CP sequence of potato virus X (PVX) into the engineered PVMV-G-A15G. Pre-inoculated plants with the recombinant PVMV-G-A15G that carries the PVX CP sequence are resistant to PVX infection. Taken together, our research demonstrates that the attenuated PVMV can be employed for delivering target virus sequence to mediate PDR.