Abstract A system for fractionating populations of living cells by velocity sedimentation in the earth's gravitational field is described. The cells start in a thin band near the top of a shallow gradient of 3% to 30% fetal calf serum in phosphate buffered saline at 4°C. Cell separation takes place primarily on the basis of size and is approximately independent of cell shape. A sharply‐defined upper limit, called the streaming limit, exists for the cell concentration in the starting band beyond which useful cell separations cannot be achieved. This limit, which varies with the type of cell being sedimented, can be significantly increased by proper choice of gradient shape. For sheep erythrocytes (sedimentation velocity of 1.6 mm/hour) it is 1.5 × 10 7 cells/ml. Measured and calculated sedimentation velocities for sheep erythrocytes are shown to be in agreement. The technique is applied to a suspension of mouse spleen cells and it is shown, using an electronic cell counter and pulse height analyzer, that cells are fractionated according to size across the gradient such that the sedimentation velocity (in mm/hour) approximately equals r 2 /4 where r is the cell radius in microns. Since cells of differing function also often differ in size, the system appears to have useful biological applications.

We have used the random chromosomal integration sites of retrovirus vectors as unique clonal markers to analyze cell lineage relationships within the hemopoietic stem cell hierarchy. Using a high efficiency protocol for retrovirus-mediated gene transfer, anemic W/Wv mutant mice were reconstituted with bone marrow cells infected with a NEO vector. Analysis of the DNA from bone marrow, thymus, and spleen of these reconstituted W/Wv mice indicated insertion of the vector into primitive pluripotent stem cells capable of producing both myeloid and lymphoid progeny as well as into more committed stem cells apparently restricted to either the myeloid or lymphoid lineages. The neo gene was also expressed in these mice, as they contained a variety of G418 resistant in vitro colony-forming cells. These results demonstrate high-efficiency gene transfer and expression in primitive hemopoietic stem cells and provide a direct approach for analyzing the hemopoietic stem cell hierarchy.

A process unique to lymphocyte differentiation is the rearrangement of genes encoding antigen-specific receptors on B and T cells. A mouse mutant (C.B-17scid) with severe combined immune deficiency, i.e., that lacks functional B and T cells, shows no evidence of such gene rearrangements. However, rearrangements were detected in Abelson murine leukemia virus-transformed bone marrow cells and in spontaneous thymic lymphomas from C.B-17scid mice. Most of these rearrangements were abnormal: ∼80% of Igh rearrangements deleted the entire Jh region, and ∼60% of TCRβ rearrangements deleted the entire Jβ2 region. The deletions appeared to result from faulty D-to-J recombination. No such abnormal rearrangements were detected in transformed tissues from control mice. The scid mutation may adversely affect the recombinase system catalyzing the assembly of antigen receptor genes in developing B and T lymphocytes.

Survivors of the heritable form of retinoblastoma subsequently develop second primary osteosarcomas at substantially greater frequency than either the general population or survivors of nonheritable retinoblastoma. Here we present molecular genetic evidence that the development of these two disparate tumor types involves specific somatic loss of constitutional heterozygosity for the region of human chromosome 13 that includes the RB1 locus. Similar events occur during the genesis of nonheritable osteosarcoma but not in several other embryonal tumors or sarcomas. These findings suggest that a conceptual approach toward defining the number of genes whose recessive mutant forms predispose to cancer is the molecular genetic analysis of clinically associated tumor types. They also suggest that the molecular basis of mixed cancer families may be the differential expression of a single pleiotropic recessive mutation by tissue specific mitotic segregation abnormalities.

Retinoblastoma is one of several human tumors to which predisposition can be inherited. Molecular genetic analysis of several nonheritable cases has led to the hypothesis that this tumor develops after the occurrence of specific mitotic events involving human chromosome 13. These events reveal initial predisposing recessive mutations. Evidence is presented that similar chromosomal events occur in tumors from heritable cases. The chromosome 13 found in the tumors was the one carrying the predisposing germline mutation and not the homolog containing the wild-type allele at the Rb-1 locus. These results suggest a new approach for identifying recessive mutant genes that lead to cancer and a conceptual basis for accurate prenatal predictions of cancer predisposition.

Spleen cells from C.B- 17 scid mice with severe combined immunodeficiency disease exhibit natural killer cell (NK) activity against YAC lymphoma targets in a standard 4-hr 51Cr release assay. The cytolytic activity is demonstrable only at high effector to target ratios but can be augmented at least sevenfold by the interferon inducer poly I:C. The pattern of target lysis is specific, because splenocytes from poly I:C-primed C.B-17 scid mice lyse NK-sensitive YAC cells and not the insensitive P815 mastocytoma. The presence of several NK-associated antigens on C.B-17 scid splenocytes was tested by pretreating cells with the appropriate antiserum plus complement before testing for NK activity. The results indicate that a proportion of NK effectors in C.B-17 scid mice bear surface NK 2.1 and Asialo GM1 but are negative for Thy-1.

The results of this controlled study of the treatment of 57 patients with Gilles de la Tourette's syndrome suggested that both haloperidol and pimozide were more effective than placebo, but that haloperidol was slightly more effective than pimozide. Adverse effects occurred more frequently with haloperidol vs placebo than with pimozide vs placebo, but the frequency was not significantly different for haloperidol compared with pimozide. Clinically significant cardiac effects did not occur at a maximum dosage of 0.3 mg/kg or 20 mg/d for pimozide and 10 mg/d for haloperidol. However, the QTc interval was prolonged during pimozide treatment compared with that during haloperidol treatment, although the values for both medications were not in an abnormal range.

Genomic enhancer elements regulate gene expression programs important for neuronal fate and function and are implicated in brain disease states. Enhancers undergo bidirectional transcription to generate non-coding enhancer RNAs (eRNAs). However, eRNA function remains controversial. Here, we combined ATAC-Seq and RNA-Seq datasets from three distinct neuronal culture systems in two activity states, enabling genome-wide enhancer identification and prediction of putative enhancer-gene pairs based on correlation of transcriptional output. Notably, stimulus-dependent enhancer transcription preceded mRNA induction, and CRISPR- based activation of eRNA synthesis increased mRNA at paired genes, functionally validating enhancer-gene predictions. Focusing on enhancers surrounding the Fos gene, we report that targeted eRNA manipulation bidirectionally modulates Fos mRNA, and that Fos eRNAs directly interact with the histone acetyltransferase domain of the enhancer-linked transcriptional co-activator CBP. Together, these results highlight the unique role of eRNAs in neuronal gene regulation and demonstrate that eRNAs can be used to identify putative target genes.