Abstract CDCA7 , encoding a protein with a C-terminal cysteine-rich domain (CRD), is mutated in immunodeficiency, centromeric instability and facial anomalies (ICF) syndrome, a disease related to hypomethylation of juxtacentromeric satellite DNA. How CDCA7 directs DNA methylation to juxtacentromeric regions is unknown. Here, we show that the CDCA7 CRD adopts a unique zinc-binding structure that recognizes a CpG dyad in a non-B DNA formed by two sequence motifs. CDCA7, but not ICF mutants, preferentially binds the non-B DNA with strand-specific CpG hemi-methylation. The unmethylated sequence motif is highly enriched at centromeres of human chromosomes, whereas the methylated motif is distributed throughout the genome. At S phase, CDCA7, but not ICF mutants, is concentrated in constitutive heterochromatin foci, and the formation of such foci can be inhibited by exogenous hemi-methylated non-B DNA bound by the CRD. Binding of the non-B DNA formed in juxtacentromeric regions during DNA replication provides a mechanism by which CDCA7 controls the specificity of DNA methylation.

Abstract The mammalian SWI/SNF complex is an ATP-dependent chromatin remodeler and master regulator in development that when mutated is the cause for several human diseases including cancer. Although SWI/SNF is highly enriched at enhancers and its basic chromatin remodeling activities have been studied for over 30 years, there is little known about how it regulates enhancer activity or enhancer-promoter interactions. We find a putative RNA binding module located near the C-terminus of the catalytic subunit of SWI/SNF required for SWI/SNF recruitment to cell-type specific enhancers and super-enhancers in naïve and cell lineage primed pluripotent cells. The AT-hook is required for acquisition of the active histone marks H3K27ac and H3K4me1 and recruitment of the MLL3/4 co-activator to these enhancers and super-enhancers. Consistent with changes in enhancer architecture, loss of the AT-hook interferes with activation of genes involved in cell lineage priming as well as genes normally activated in naïve pluripotent cells.

ABSTRACT BACKGROUND Echocardiography-guided percutaneous intramyocardial septal radiofrequency ablation (PIMSRA, Liwen procedure) is a novel treatment option for hypertrophic obstructive cardiomyopathy (HOCM). The safety and feasibility of using this procedure for cryoablation are unknown. OBJECTIVE To establish a canine model for echocardiography-guided percutaneous intramyocardial septal cryoablation (PIMSCA). METHODS Eight canines underwent PIMSCA and had electrocardiography, echocardiography, myocardial contrast echocardiography (MCE), (ECG), serological and pathological examinations during the preoperative, immediate postoperative, and in 6-month follow-up. RESULTS All eight canines underwent successful cryoablation and continued to be in sinus rhythm during ablation and without malignant arrhythmias. MCE showed that ablation area had decreased myocardial perfusion after procedure. Troponin I levels were significantly elevated [0.010 (0.005, 0.297) ng/mL vs. 3.122 (1.152,7.990) ng/mL, p < 0.05)]. At follow-up 6-months after procedure, all animals were alive, with thinning of the interventricular septum (7.26 ± 0.52 mm vs. 3.86 ± 0.29 mm, p < 0.05). Echocardiography showed no significant decrease in left ventricular ejection fractions (LVEF) (54.32 ± 2.93 %vs. 54.70 ± 2.47 %, p > 0.05) or changes by pulse-wave Doppler E/A (1.17 ± 0.43 vs. 1.07 ± 0.43, p > 0.05), E/e’(8.09 ± 1.49 vs. 10.05 ±2.68, p > 0.05). Pathological findings proved effective cryoablation in myocardial tissues. We observed pericardial effusions and premature ventricular complexes (PVCs) associated with the procedure. CONCLUSION Our findings provide preliminary evidence of the safety and feasibility of PIMSACA in interventricular septum reduction, which provides a potentially new treatment option for HOCM.

Abstract Invasive membrane protrusions play a central role in a variety of cellular processes. Unlike filopodia, invasive protrusions are mechanically stiff and propelled by branched actin polymerization. However, how branched actin filaments are organized to create finger-like invasive protrusions remains a longstanding question in cell biology. Here, by examining the mammalian fusogenic synapse, where invasive protrusions are generated to promote cell membrane juxtaposition and fusion, we have uncovered the mechanism underlying invasive protrusion formation. We show that two Arp2/3 nucleation promoting factors (NPFs), WAVE and N-WASP, exhibit distinct and complementary localization patterns in the protrusions. While WAVE is at the leading edge, N-WASP is recruited by its interacting protein, WIP, to the shaft of the protrusion. During protrusion growth, new branched actin filaments are polymerized at the periphery of the shaft and crosslinked to preexisting actin bundles by the “pioneer” actin-bundling protein dynamin. The thickened actin bundles are further stabilized by WIP, which functions as a WH2 domain-mediated actin-bundling protein. Disrupting any of these components results in defective protrusions and myoblast fusion in cultured cells and/or in mouse embryos. Thus, our study has revealed the intricate spatiotemporal coordination between two NPFs and two actin-bundling proteins in creating invasive protrusions and has general implications in understanding protrusion formation in many cellular processes beyond cell-cell fusion.

ABSTRACT Background ChIP-Seq is a powerful method commonly used to study global protein-DNA interactions including both transcription factors and histone modifications. We have found that the choice of ChIP-Seq library preparation protocol plays an important role in overall ChIP-Seq data quality. However, very few studies have compared ChIP-Seq libraries prepared by different protocols using multiple targets and a broad range of input DNA levels. Results In this study, we evaluated the performance of four ChIP-Seq library preparation protocols [NEB NEBNext Ultra II, Roche KAPA HyperPrep, Diagenode MicroPlex, and Bioo (now PerkinElmer) NEXTflex] on three target proteins, chosen to represent the three typical signal enrichment patterns in ChIP-Seq experiments: sharp peaks (H3K4me3), broad domains (H3K27me3) and punctate peaks with a protein binding motif (CTCF). We also tested a broad range of different input DNA levels from 0.10 to 10 ng for H3K4me3 and H3K27me3 experiments. Conclusions Our results suggest that the NEB protocol may be better for preparing H3K4me3 (and potentially other histone modifications with sharp peak enrichment) libraries; the Bioo protocol may be better for preparing H3K27me3 (and potentially other histone modifications with broad domain enrichment) libraries, and the Diagenode protocol may be better for preparing CTCF (and potentially other transcription factors with well-defined binding motifs) libraries. For ChIP-Seq experiments using novel targets without a known signal enrichment pattern, the NEB protocol might be the best choice as it performed well for each of the three targets we tested across a wide array of input DNA levels.

ABSTRACT WWOX gene loss-of-function (LoF) has been associated with neuropathologies resulting in developmental, epileptic, and ataxic phenotypes of varying severity based on the level of WWOX dysfunction. WWOX gene biallelic germline variant p.Pro47Thr (P47T) has been causally associated with a new form of autosomal recessive cerebellar ataxia with epilepsy and intellectual disability (SCAR12). This mutation affects the WW1 protein binding domain of WWOX, impairing its ability to interact with canonical proline-proline-X-tyrosine motifs in partner proteins. We generated a mutant knock-in mouse model of Wwox P47T that phenocopies SCAR12. Wwox P47T/P47T mice displayed epilepsy, profound social behavior and cognition deficits, and poor motor coordination, and unlike KO models that survive only for 1 month, live beyond 1 year of age. These deficits progressed with age, and mice became practically immobile, suggesting severe cerebellar dysfunction. Wwox P47T/P47T mice exhibited signs of progressive neuroinflammation with elevated astro-microgliosis that increased with age. The cerebellar cortex displayed significantly reduced molecular and granular layer thickness and a strikingly reduced number of Purkinje cells with degenerated dendrites. Transcriptome profiling from various brain regions from these Wwox LoF mice highlighted widespread changes in neuronal and glial pathways, enrichment of bioprocesses related to neuroinflammation and severe cerebellar dysfunction, activation of pathways compatible with compensatory neurogenesis along with major suppression of gene networks associated with excitability, neuronal cell differentiation and brain development. Our results show significant pathobiological effects and potential mechanisms through which WWOX LoF leads to epilepsy, cerebellar neurodegeneration, neuroinflammation, and ataxia. Additionally, the mouse model described here will be a useful tool for the study of WWOX in common neurodegenerative conditions in which it has been identified as a novel risk factor.

Abstract The discovery of microbial-derived DNA-interacting agents, which hold broad therapeutic potential, is inherently challenging due to the limited sensitivity and specificity of conventional methodologies. Our study introduces a pioneering application of single-molecule stretching assay (SMSA) in natural product chemistry to identify DNA-intercalating agents directly from microbial cultures or extracts. We demonstrate that mechanical force can enhance sensitivity by increasing both the binding affinity K a and the quantity of ligands bound. The changes induced by intercalators in the counter length and overstretching transition of dsDNA yield a distinctive and highly specific signature indicative of DNA intercalative binding, thereby enabling straightforward detection of DNA intercalators even in trace amounts from microbial cultures. This methodology eliminates the need for extensive large-scale fermentation and purification processes, thus offering a more streamlined approach to DNA-intercalating natural product discovery. By applying SMSA to 17 microorganisms, we identified two DNA intercalator-producing strains: Streptomyces tanashiensis and Talaromyces funiculosus . Subsequently, three DNA intercalators, namely medermycin, kalafungin, and ligustrone B, were isolated and characterized. Among them, medermycin and kalafungin showed significant inhibitory effects against HCT-116 cancer cells, with IC 50 values of 52 ± 6 nM and 70 ± 7 nM, respectively.

Abstract Thermodynamics and structural transitions on protein surfaces remain relatively understudied and poorly understood. Wrapping of DNA on proteins provides a paradigm for studying protein surfaces. We used magnetic tweezers to investigate a prototypical DNA-interacting protein, i.e., the single-stranded DNA binding protein (SSB). SSB binds DNA with distinct binding modes the mechanism of which is still elusive. The measured thermodynamic parameters relevant to the SSB-DNA complex are salt-dependent and discontinuous at the bind-mode transitions. Our data indicate that free SSB undergoes salt-induced first-order structural transitions. The conclusion was supported by the infrared spectroscopy of SSB in salt solutions. Ultrafast infrared spectroscopy further suggests that the transitions are correlated with surface salt bridges. Our work not only unravels a long-standing mystery of the different binding site sizes of SSB, but also would inspire interests in thermodynamics of protein surfaces.

Abstract The acoustic environment an animal experiences early in life shapes the structure and function of its auditory system. This process of experience-dependent development is thought to be primarily orchestrated by potentiation and depression of synapses, but plasticity of intrinsic voltage dynamics may also contribute. Here we show that at the peak of the critical period for song memorization, neurons in the zebra finch caudal mesopallium, a cortical-level auditory area, can rapidly change their firing dynamics. This plasticity was only observed in birds that were reared in a complex acoustic and social environment, which also caused increased expression of the low-threshold potassium channel Kv1.1 in the plasma membrane and endoplasmic reticulum. Intrinsic plasticity depended on activity, was reversed by blocking low-threshold potassium currents, and was prevented by blocking intracellular calcium signaling. Taken together, these results suggest that Kv1.1 is rapidly mobilized to the plasma membrane by activity-dependent elevation of intracellular calcium. This produces a shift in the excitability and temporal integration of CM neurons that may be permissive for auditory learning in complex acoustic environments during a crucial period for the development of vocal perception and production.