Associative memory is the main type of learning wherein complex organisms endowed with evolved nervous systems respond efficiently to determined environmental stimuli. This fundamental cognitive property has been evidenced in different multicellular species, from cephalopods to Humans, but never in individual cells. Here, following Pavlov's experiments with dogs that founded the principles of classical conditioning, we have observed the development of an associative memory in Amoeba proteus, which corresponds to the emergence of a new systemic motility pattern. In our cellular version of this conditioning behavior, we have used a controlled direct current electric field as the conditioned stimulus and a specific chemotactic peptide as the non-conditioned stimulus. Our study allowed us to demonstrate that Amoeba proteus are capable of linking two independent past events, and the induced associative memory can be recorded for up to at least four hours. For the first time, it has been observed that a systemic response to a specific stimulus can be modified by learning in unicellular organisms. This finding opens up a new framework in the understanding of the mechanisms underlying the complex systemic behavior involved in the cellular migration and the adaptive capacity of cells to the external medium.

Directional motility is an essential property of cells. Despite its enormous relevance in many fundamental physiological and pathological processes, how cells control their locomotion movements remains an unresolved question. Here we have addressed the systemic processes driving the directed locomotion of cells. Specifically, we have performed an exhaustive study analyzing the trajectories of 700 individual cells belonging to three different species (Amoeba proteus, Metamoeba leningradensis and Amoeba borokensis) in four different scenarios: in absence of stimuli, under an electric field (galvanotaxis), in a chemotactic gradient (chemotaxis), and under simultaneous galvanotactic and chemotactic stimuli. All movements were analyzed using advanced quantitative tools. The results show that the trajectories are mainly characterized by coherent integrative responses that operate at the global cellular scale. These systemic migratory movements depend on the cooperative non-linear interaction of most, if not all, molecular components of cells.

Abstract The capacity to learn new systemic behaviour is a fundamental issue to understand the adaptive mechanisms involved in cellular evolution. We have recently observed, in a preliminary analysis, the emergence of conditioned behaviour in individual amoebae cells. In these experiments, cells were able to acquire new migratory conduct and remember it for long periods of their cellular cycle, forgetting it later on. Here, following a similar conceptual framework of Pavlov’s experiments, we have exhaustively studied the migration trajectories of more than 2000 individual cells belonging to three different species: Amoeba proteus, Metamoeba leningradensis , and Amoeba borokensis . Fundamentally, we have analysed several properties of conditioned cells, such as the intensity of the responses, the directionality persistence, the total distance traveled, the directionality ratio, the average speed, and the persistence times. We have observed that these three species can modify the systemic response to a specific stimulus by associative conditioning. Our main analysis shows that such new behaviour is very robust and presents a similar structure of migration patterns in the three species, which was characterized by the presence of conditioning for long periods, remarkable straightness in their trajectories and strong directional persistence. Our quantitative results, compared with other studies on complex cellular responses in bacteria, protozoa, fungus-like organisms and metazoans, allow us to conclude that cellular associative conditioning might be a widespread characteristic of unicellular organisms. This finding could be essential to understand some key evolutionary principles involved in increasing the cellular adaptive fitness to microenvironments.

How motile, free unicellular organisms maximize the rate at which they encounter resources and develop optimal search strategies remains largely unknown. In fact, cell foraging is a very complex activity in which unicellular organisms integrate a diversity of external cues and develop efficient systemic movements to localize nourishment. These foraging strategies are critical when cells face conditions of scarce resources or they don't possess information on where food is located. Here, in order to determine whether nuclear activity is directly involved in cell migration, we placed single, well-isolated, enucleated and non-enucleated starved Amoeba proteus on nutrient-free petri dishes, and we then analyzed their trajectories of movement using non-linear dynamic tools. We found that despite being enucleated, the systemic responses of the protoplasm exhibited typical biological behaviors, moving with apparent normality, creeping along the substrate, developing pseudopodia and gobbling up prey. Our quantitative studies show that both the non-enucleated and enucleated amoebas display a similar migration structure, characterized by super-diffusivity, non-trivial long-term correlations and move-step fluctuations with scale invariant properties. In conclusion, the nuclear activity does not seem to directly control the systemic cellular movements involved in locating sparse resources.