Clostridium difficile is the leading cause of infectious diarrhoea in hospitals worldwide, because of its virulence, spore-forming ability and persistence. C. difficile-associated diseases are induced by antibiotic treatment or disruption of the normal gastrointestinal flora. Recently, morbidity and mortality resulting from C. difficile-associated diseases have increased significantly due to changes in the virulence of the causative strains and antibiotic usage patterns. Since 2002, epidemic toxinotype III NAP1/027 strains, which produce high levels of the major virulence factors, toxin A and toxin B, have emerged. These toxins have 63% amino acid sequence similarity and are members of the large clostridial glucosylating toxin family, which are monoglucosyltransferases that are pro-inflammatory, cytotoxic and enterotoxic in the human colon. Inside host cells, both toxins catalyse the transfer of glucose onto the Rho family of GTPases, leading to cell death. However, the role of these toxins in the context of a C. difficile infection is unknown. Here we describe the construction of isogenic tcdA and tcdB (encoding toxin A and B, respectively) mutants of a virulent C. difficile strain and their use in the hamster disease model to show that toxin B is a key virulence determinant. Previous studies showed that purified toxin A alone can induce most of the pathology observed after infection of hamsters with C. difficile and that toxin B is not toxic in animals unless it is co-administered with toxin A, suggesting that the toxins act synergistically. Our work provides evidence that toxin B, not toxin A, is essential for virulence. Furthermore, it is clear that the importance of these toxins in the context of infection cannot be predicted exclusively from studies using purified toxins, reinforcing the importance of using the natural infection process to dissect the role of toxins in disease.

Progress in exploiting clostridial genome information has been severely impeded by a general lack of effective methods for the directed inactivation of specific genes. Those few mutants that have been generated have been almost exclusively derived by single crossover integration of a replication-deficient or defective plasmid by homologous recombination. The mutants created are therefore unstable. Here we have adapted a mutagenesis system based on the mobile group II intron from the ltrB gene of Lactococcus lactis (Ll.ltrB) to function in clostridial hosts. Integrants are readily selected on the basis of acquisition of resistance to erythromycin, and are generated from start to finish in as little as 10 to 14 days. Unlike single crossover plasmid integrants, the mutants are extremely stable. The system has been used to make 6 mutants of Clostridium acetobutylicum and 5 of Clostridium difficile, exceeding the number of published mutants ever generated in these species. Genes have also been inactivated for the first time in Clostridium botulinum and Clostridium sporogenes, suggesting the system will be universally applicable to the genus. The procedure is highly efficient and reproducible, and should revolutionize functional genomic studies in clostridia.

Clostridium difficile is a leading cause of antibiotic-associated diarrhea, a significant animal pathogen, and a worldwide public health burden. Most disease-causing strains secrete two exotoxins, TcdA and TcdB, which are considered to be the primary virulence factors. Understanding the role that these toxins play in disease is essential for the rational design of urgently needed new therapeutics. However, their relative contributions to disease remain contentious. Using three different animal models, we show that TcdA(+) TcdB(-) mutants are attenuated in virulence in comparison to the wild-type (TcdA(+) TcdB(+)) strain, whereas TcdA(-) TcdB(+) mutants are fully virulent. We also show for the first time that TcdB alone is associated with both severe localized intestinal damage and systemic organ damage, suggesting that this toxin might be responsible for the onset of multiple organ dysfunction syndrome (MODS), a poorly characterized but often fatal complication of C. difficile infection (CDI). Finally, we show that TcdB is the primary factor responsible for inducing the in vivo host innate immune and inflammatory responses. Surprisingly, the animal infection model used was found to profoundly influence disease outcomes, a finding which has important ramifications for the validation of new therapeutics and future disease pathogenesis studies. Overall, our results show unequivocally that TcdB is the major virulence factor of C. difficile and provide new insights into the host response to C. difficile during infection. The results also highlight the critical nature of using appropriate and, when possible, multiple animal infection models when studying bacterial virulence mechanisms.Clostridium difficile is a leading cause of antibiotic-associated diarrhea and an important hospital pathogen. TcdA and TcdB are thought to be the primary virulence factors responsible for disease symptoms of C. difficile infections (CDI). However, the individual contributions of these toxins to disease remain contentious. Using three different animal models of infection, we show for the first time that TcdB alone causes severe damage to the gut, as well as systemic organ damage, suggesting that this toxin might be responsible for MODS, a serious but poorly understood complication of CDI. These findings provide important new insights into the host response to C. difficile during infection and should guide the rational development of urgently required nonantibiotic therapeutics for the treatment of CDI.

The multidrug-resistant bacterium Enterococcus faecium has become increasingly tolerant to the alcohols in hospital disinfectants.

Abstract Alcohol-based hand rubs are international pillars of hospital infection control, restricting transmission of pathogens such as Staphylococcus aureus . Despite this success, health care infections caused by Enterococcus faecium (Efm) - another multidrug resistant pathogen - are increasing. We tested alcohol tolerance of 139 hospital Efm isolates, obtained between 1997 and 2015 and found Efm post-2010 were 10-fold more tolerant to alcohol killing than older isolates. Using a mouse infection control model, we then showed that alcohol tolerant Efm resisted standard 70% isopropanol surface disinfection and led to gastrointestinal colonization significantly more often than alcohol sensitive Efm. We next looked for bacterial genomic signatures of adaptation. Tolerant Efm have independently accumulated mutations modifying genes involved in carbohydrate uptake and metabolism. Mutagenesis confirmed their roles in isopropanol tolerance. These findings suggest bacterial adaptation and complicate infection control recommendations. Additional policies and procedures to prevent Efm spread are required.

Even though Providencia alcalifaciens is considered as a normal flora of the large intestine, there are reports of it causing diarrhea. In a previous study, a strain, 2939/90 obtained as a pure stool culture from a dead diarrheal patient was shown to cause invasion and actin condensation in mammalian cells, and diarrhea in a rabbit model. In a subsequent study, four TnphoA mutants of 2939/90 produced negligible invasion and actin condensation in mammalian cells. In the present study, the parent strain was sequenced by short-read and long-read sequencing, and the mutants by short read sequencing. In all four mutants, a TnphoA insertion was detected in the type three secretion system (T3SS) locus present on the largest of four plasmids (p2939_90_1) and not in a seemingly independent, functional T3SS locus on the chromosome. A survey of 52 genomes of P. alcalifaciens available in the public database identified the chromosomal T3SS locus in all strains, including both P. alcalifaciens genomic clades that we have classified as (group A) and (group B); a highly related gene layout and gene synteny flanking the locus suggested that these chromosomal loci are orthologous. There is a low sequence similarity between the chromosomal and plasmid-borne T3SS; a survey of plasmid T3SS showed its presence in only 21 of 52 genomes and mostly in group A genomes. Group A included several isolates from an outbreak of haemorrhagic diarrhea in dogs. Using prediction software (EffectiveDB), we detected several known and unknown effectors flanking the plasmid T3SS locus. The observation that TnphoA insertion only in the plasmid T3SS locus affected the invasion phenotype suggested that this locus is critical for causation of diarrhea. This leads us to conclude that a subgroup of P. alcalifaciens that possesses this plasmid-borne T3SS locus (in the case of strain, 2939/90) can cause diarrheal disease. We name this subgroup as enteropathogenic P. alcalifaciens (EPA). EPA should be included in future studies of etiology of diarrhea. A unique sequence that may be present in the T3SS locus in the plasmid may be investigated as a marker in a simple molecular test for diagnosis of EPA.

Abstract Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis (SDSE) is an emerging cause of human infection with invasive disease incidence and clinical manifestations comparable to the closely related species, Streptococcus pyogenes . Through systematic genomic analyses of 501 disseminated SDSE strains, we demonstrate extensive overlap between the genomes of SDSE and S. pyogenes. More than 75% of core genes are shared between the two species with one third demonstrating evidence of cross-species recombination. Twenty-five percent of mobile genetic element (MGE) clusters and 16 of 55 SDSE MGE insertion regions were found across species. Assessing potential cross-protection from leading S. pyogenes vaccine candidates on SDSE, 12/34 preclinical vaccine antigen genes were shown to be present in >99% of isolates of both species. Relevant to possible vaccine evasion, six vaccine candidate genes demonstrated evidence of inter-species recombination. These findings demonstrate previously unappreciated levels of genomic overlap between these closely related pathogens with implications for streptococcal pathobiology, disease surveillance and prevention.

Despite being considered a normal flora, Providencia alcalifaciens can cause diarrhea. In a previous study, strain 2939/90, obtained from a diarrheal patient, caused invasion and actin condensation in mammalian cells, and diarrhea in a rabbit model. Four TnphoA mutants of 2939/90 produced negligible invasion and actin condensation in mammalian cells. Now, the parent strain and the mutants have been sequenced to locate TnphoA insertion sites and determine the effect on virulence. A TnphoA insertion was detected in the type three secretion system (T3SS) locus on a large plasmid and not in a T3SS locus on the chromosome. In 52 genomes of P. alcalifaciens surveyed, the chromosomal T3SS locus was present in all strains, including both P. alcalifaciens genomic clades, which we classified as group A and group B. Plasmid T3SS was present in 21 of 52 genomes, mostly in group A genomes, which included isolates from an outbreak of hemorrhagic diarrhea in dogs. The TnphoA insertion only in the plasmid T3SS locus affected the invasion phenotype, suggested that this locus is critical for causation of diarrhea. We conclude that a subgroup of P. alcalifaciens that possesses this plasmid-mediated T3SS is an enteric pathogen that can cause diarrheal disease.

Abstract Among the 16 two-component systems (TCSs) in the opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus , only WalKR is essential. Like orthologous systems in other Bacillota, S. aureus WalKR controls autolysins involved in peptidoglycan remodelling and is therefore intimately involved in cell division. However, despite the importance of WalKR in S. aureus , the basis for its essentiality is not understood and the regulon poorly defined. Here, we defined a consensus WalR DNA-binding motif and the direct WalKR regulon by using functional genomics, including ChIP-seq, with a panel of isogenic walKR mutants that had a spectrum of altered activities. Consistent with prior findings, the direct regulon includes multiple autolysin genes. However, this work also revealed that WalR directly regulates at least five essential genes involved in lipoteichoic acid synthesis ( ltaS ); translation (rplK ); DNA compaction ( hup ); initiation of DNA replication ( dnaA, hup ); and purine nucleotide metabolism ( prs ). Thus, WalKR in S. aureus serves as a polyfunctional regulator that contributes to fundamental control over critical cell processes by co-ordinately linking cell wall homeostasis with purine biosynthesis, protein biosynthesis, and DNA replication. Collectively, our findings address the essentiality of this locus and highlight the importance of WalKR as a bona fide target for novel anti-staphylococcal therapeutics.

Staphylococcus epidermidis is a significant opportunistic pathogen of humans. Molecular studies in this species have been hampered by the presence of restriction-modification (RM) systems that limit introduction of foreign DNA. Here we establish the complete genomes and methylomes for seven clinically significant, genetically diverse Staphylococcus epidermidis isolates and perform the first systematic genomic analyses of the type I RM systems within both S. epidermidis and Staphylococcus aureus . Our analyses revealed marked differences in the gene arrangement, chromosomal location and movement of type I RM systems between the two species. Unlike S. aureus , S. epidermidis type I RM systems demonstrate extensive diversity even within a single genetic lineage. This is contrary to current assumptions and has important implications for approaching the genetic manipulation of S. epidermidis . Using Escherichia coli plasmid artificial modification (PAM) to express S. epidermidis hsdMS, we readily overcame restriction barriers in S. epidermidis , and achieved transformation efficiencies equivalent to those of modification deficient mutants. With these functional experiments we demonstrate how genomic data can be used to predict both the functionality of type I RM systems and the potential for a strain to be transformation proficient. We outline an efficient approach for the genetic manipulation of S. epidermidis from diverse genetic backgrounds, including those that have hitherto been intractable. Additionally, we identified S. epidermidis BPH0736, a naturally restriction defective, clinically significant, multidrug-resistant ST2 isolate as an ideal candidate for molecular studies.