The efficacy and the mutation spectrum of genome editing methods can vary substantially depending on the targeted sequence. A simple, quick assay to accurately characterize and quantify the induced mutations is therefore needed. Here we present TIDE, a method for this purpose that requires only a pair of PCR reactions and two standard capillary sequencing runs. The sequence traces are then analyzed by a specially developed decomposition algorithm that identifies the major induced mutations in the projected editing site and accurately determines their frequency in a cell population. This method is cost-effective and quick, and it provides much more detailed information than current enzyme-based assays. An interactive web tool for automated decomposition of the sequence traces is available. TIDE greatly facilitates the testing and rational design of genome editing strategies.

The spatial organization of chromosomes influences many nuclear processes including gene expression. The cohesin complex shapes the 3D genome by looping together CTCF sites along chromosomes. We show here that chromatin loop size can be increased and that the duration with which cohesin embraces DNA determines the degree to which loops are enlarged. Cohesin’s DNA release factor WAPL restricts this loop extension and also prevents looping between incorrectly oriented CTCF sites. We reveal that the SCC2/SCC4 complex promotes the extension of chromatin loops and the formation of topologically associated domains (TADs). Our data support the model that cohesin structures chromosomes through the processive enlargement of loops and that TADs reflect polyclonal collections of loops in the making. Finally, we find that whereas cohesin promotes chromosomal looping, it rather limits nuclear compartmentalization. We conclude that the balanced activity of SCC2/SCC4 and WAPL enables cohesin to correctly structure chromosomes.

The nuclear lamina (NL) interacts with hundreds of large genomic regions termed lamina associated domains (LADs). The dynamics of these interactions and the relation to epigenetic modifications are poorly understood. We visualized the fate of LADs in single cells using a "molecular contact memory" approach. In each nucleus, only ∼30% of LADs are positioned at the periphery; these LADs are in intermittent molecular contact with the NL but remain constrained to the periphery. Upon mitosis, LAD positioning is not detectably inherited but instead is stochastically reshuffled. Contact of individual LADs with the NL is linked to transcriptional repression and H3K9 dimethylation in single cells. Furthermore, we identify the H3K9 methyltransferase G9a as a regulator of NL contacts. Collectively, these results highlight principles of the dynamic spatial architecture of chromosomes in relation to gene regulation.

Mammalian interphase chromosomes interact with the nuclear lamina (NL) through hundreds of large lamina-associated domains (LADs). We report a method to map NL contacts genome-wide in single human cells. Analysis of nearly 400 maps reveals a core architecture consisting of gene-poor LADs that contact the NL with high cell-to-cell consistency, interspersed by LADs with more variable NL interactions. The variable contacts tend to be cell-type specific and are more sensitive to changes in genome ploidy than the consistent contacts. Single-cell maps indicate that NL contacts involve multivalent interactions over hundreds of kilobases. Moreover, we observe extensive intra-chromosomal coordination of NL contacts, even over tens of megabases. Such coordinated loci exhibit preferential interactions as detected by Hi-C. Finally, the consistency of NL contacts is inversely linked to gene activity in single cells and correlates positively with the heterochromatic histone modification H3K9me3. These results highlight fundamental principles of single-cell chromatin organization.Video AbstracteyJraWQiOiI4ZjUxYWNhY2IzYjhiNjNlNzFlYmIzYWFmYTU5NmZmYyIsImFsZyI6IlJTMjU2In0.eyJzdWIiOiI4ODQ5MWUxMzY3ZjJjYzMyZGY0ZTUwNDM4ZDkzODI2YiIsImtpZCI6IjhmNTFhY2FjYjNiOGI2M2U3MWViYjNhYWZhNTk2ZmZjIiwiZXhwIjoxNjc4NDQ3NzA5fQ.WDISeQbMars3afd3xU31ad0as2CapR6MBdvrmShLZbNLL7pc4Oa_VcEGoid_8nFRk8gToTt_3kYc1VG3v53Dp3VPaqIy-d5IFFkTbJdYat98x2tWpWt6ONCnsutlxJI_Il6mHghaVyN8qydH-fumo9rQ_uLcfIWaVkgcmSs1YFmIj5IxiAlo0WQNe2ckYcP4hP2AM-VJvaLwOyGINV8Z78bXOw73T0RROTCsI6K5HfTTtleYucPrYM4NLiV2Jl7BM50WQYNPtJZRWmFvAHdCqPh1Cf3CFxSMWblyFINEwDfQhB7L7lN8jlQAO-DGSgRGoqmWnmG6eqcZUGQTFybHXA(mp4, (21.94 MB) Download video

Abstract Lysosomal acid lipase deficiency (LAL-D) is an autosomal recessive disorder caused by mutations in the LIPA gene, which results in lipid accumulation leading to multi-organ failure. If left untreated, the severe form of LAL-D results in premature death within the first year of life due to failure to thrive and hepatic insufficiency. Enzyme replacement therapy is the only available supportive treatment consisting in weekly systemic injections of recombinant LAL protein. Here, we characterized a novel Lipa -/- mouse model and developed a curative gene therapy treatment based on the in vivo administration of recombinant (r)AAV8 vector encoding the human LIPA transgene under the control of a hepatocyte-specific promoter. We defined the minimal rAAV8 dose required to rescue disease lethality and to correct cholesterol and triglyceride accumulation in multiple organs and blood. Finally, using liver transcriptomic and biochemical analysis, we showed mitochondrial impairment in Lipa -/- mice and its recovery by gene therapy. Overall, our in vivo gene therapy strategy achieves a stable long-term LAL expression sufficient to correct the disease phenotype in the Lipa -/- mouse model and offers a new therapeutic option for LAL-D patients. One Sentence Summary We’ve developed a liver-targeted gene therapy using recombinant AAV8 to effectively cure Lysosomal acid lipase deficiency by correcting lipid accumulation and by normalizing gene expression pattern and mitochondrial function in Lipa -/- mouse model.

Abstract Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a lethal neuromuscular disorder caused by loss of dystrophin. Upregulation of utrophin (UTRN), a dystrophin paralogue, is a promising therapeutic avenue. Here, we present a CRISPR-Cas9-mediated strategy to increase utrophin expression by disrupting microRNA (miR) binding sites (BS). Using a Cas9/gRNA ribonucleoprotein (RNP) complex we disrupted several miR BS in DMD myoblasts and selected the Let-7c BS has crucial for UTRN repression. Interestingly, Cas9/gRNA indels were as efficient as the complete removal of Let-7c BS in upregulating UTRN expression, without any major off-targets. In three-dimensional human DMD cultures, Cas9/gRNA-mediated editing resulted in significant utrophin upregulation and functional improvements of calcium dysregulation and muscle contraction. Finally, Let-7c BS disruption in mdx animals by systemic rAAVs mediated delivery of Cas9 and gRNA resulted in utrophin upregulation and amelioration of the muscle histopathological phenotype. These findings provide the foundations for a universal (mutation-independent) gene editing therapeutic strategy for DMD. One Sentence Summary CRISPR-Cas9 has the potential to upregulate utrophin to treat all DMD patients.

Abstract Sickle cell disease (SCD) is due to a mutation in the β-globin ( HBB ) gene causing the production of the toxic sickle hemoglobin (HbS, a 2 β S 2 ). Transplantation of autologous hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) transduced with lentiviral vectors (LVs) expressing an anti-sickling β-globin (βAS) is a promising treatment; however, it is only partially effective and patients still present elevated HbS levels. Here, we developed a bifunctional LV expressing βAS3-globin and an artificial microRNA (amiR) specifically downregulating β S -globin expression with the aim of reducing HbS levels and favoring βAS3 incorporation into Hb tetramers. Efficient transduction of SCD HSPC by the bifunctional LV led to a substantial decrease of β S -globin transcripts in HSPC-derived erythroid cells, a significant reduction of HbS + red cells and effective correction of the sickling phenotype, outperforming βAS gene addition and BCL11A gene silencing strategies. The bifunctional LV showed a standard integration profile and neither the HSPC viability, engraftment and multi-lineage differentiation nor the erythroid transcriptome and miRNAome were affected by the treatment, confirming the safety of this therapeutic strategy. In conclusion, the combination of gene addition and gene silencing strategies can improve the efficacy of current LV-based therapeutic approaches without increasing the mutagenic vector load, thus representing a novel treatment for SCD.