Reactive oxygen species (ROS) produced by the NADPH oxidase, respiratory burst oxidase homolog (RBOH), trigger signal transduction in diverse biological processes in plants. However, the functions of RBOH homologs in rice (Oryza sativa) and other gramineous plants are poorly understood. Ethylene induces the formation of lysigenous aerenchyma, which consists of internal gas spaces created by programmed cell death of cortical cells, in roots of gramineous plants under oxygen-deficient conditions. Here, we report that, in rice, one RBOH isoform (RBOHH) has a role in ethylene-induced aerenchyma formation in roots. Induction of RBOHH expression under oxygen-deficient conditions was greater in cortical cells than in cells of other root tissues. In addition, genes encoding group I calcium-dependent protein kinases (CDPK5 and CDPK13) were strongly expressed in root cortical cells. Coexpression of RBOHH with CDPK5 or CDPK13 induced ROS production in Nicotiana benthamiana leaves. Inhibitors of RBOH activity or cytosolic calcium influx suppressed ethylene-induced aerenchyma formation. Moreover, knockout of RBOHH by CRISPR/Cas9 reduced ROS accumulation and inducible aerenchyma formation in rice roots. These results suggest that RBOHH-mediated ROS production, which is stimulated by CDPK5 and/or CDPK13, is essential for ethylene-induced aerenchyma formation in rice roots under oxygen-deficient conditions.

Exposing plants to hypoxic conditions greatly improves their anoxic stress tolerance by enhancing the activities of glycolysis and fermentation in roots. Ethylene may also be involved in these adaptive responses because its synthesis is increased in roots under hypoxic conditions. Here it is reported that pre-treatment of wheat seedlings with an ethylene precursor, 1-aminocyclopropanecarboxylic acid (ACC), enhanced accumulation of ethylene in the roots of wheat seedlings, and enhanced their tolerance of oxygen-deficient conditions through increasing the expression of genes encoding ethanol fermentation enzymes, alcohol dehydrogenase and pyruvate decarboxylase, in the roots. Lysigenous aerenchyma formation in root was induced by ACC pre-treatment and was further induced by growth under oxygen-deficient conditions. ACC pre-treatment increased the expression of three genes encoding respiratory burst oxidase homologue (a plant homologue of gp91phox in NADPH oxidase), which has a role in the generation of reactive oxygen species (ROS), in roots of seedlings. Co-treatment with ACC and an NADPH oxidase inhibitor, diphenyleneiodonium, partly suppressed the ACC-induced responses. These results suggest that ethylene and ROS are involved in adaptation of wheat seedlings to oxygen-deficient conditions through controlling lysigenous aerenchyma formation and the expression of genes encoding ethanol fermentation enzymes.

Summary Salt tolerance is important to tackle problems of soil salinization and ground water depletion. However, developing salt tolerant crops is facing difficulties due to limited potential in model plants and crop species. Thus, it is important to elucidate how coastal species, such as Vigna marina , adapt to saline environments. By comparative transcriptome and histological analyses, this study elucidated one important aspect of how Vigna marina achieves salt exclusion and extraordinary salt tolerance. Under salt stress, genes involved in casparian strip formation were specifically upregulated in JP247202 ( V. marina ). JP247202 reinforced apoplastic barrier with thick lignification in multiple layers of cells around endodermis. Also, disruption of lignification led to a dramatic increase of shoot Na + accumulation and salt lesion in JP247202. Interestingly, despite the salt-induced apoplastic barrier, JP247202 maintained transport of essential ions including K + , Mg 2+ , and Ca 2+ . Our results revealed that lignification of multi-layered cells around endodermis was an important apoplastic barrier to the transport of Na + to shoots in JP247202, while it did not restrict the transport of K + , Mg 2+ , and Ca 2+ . This feature, together with the ability of Na + excretion by SOS1, enables V. marina to thrive in marine beaches.

Abstract Soil salinization and ground water depletion are increasingly constraining crop production. Identifying useful mechanisms of salt tolerance is an important step towards development of salt-tolerant crops. Of particular interest are mechanisms that are present in wild crop relatives, as they may have greater stress tolerance than crop species. The coastal species Vigna marina is one of the promising plant resources for salt tolerance. V. luteola is another wild species with diverse habitats including seaside and riverbank, hereafter, V. luteola-beach and V. luteola-river, respectively. By comparative transcriptome and histological analyses, this study elucidated one important aspect of how V. marina achieves an extraordinary ability to suppress Na+ uptake. Under salt stress, V. marina specifically upregulated genes involved in Casparian strip formation and developed a multi-layered lignified apoplastic barrier around endodermis, whereas V. luteola-beach formed typical, band-like Casparian strips, and V. luteola-river formed only spot-like Casparian strips. As such, the ability of developing apoplastic barrier strongly correlated with those of suppressing Na+ uptake. The disruption of lignified barrier led to a dramatic increase of Na+ allocation to the shoot in V. marina, which was manifested in leaf etiolation and burning. Interestingly, despite the presence of reinforced apoplastic barrier, V. marina maintained transport of essential ions including K+, Mg2+, and Ca2+. This study shows the multi-layered Casparian strip-like structure plays important role in salt tolerance.

CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE (CDPK) stimulates reactive oxygen species (ROS)-dependent signaling by activating RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH). The lysigenous aerenchyma is a gas space created by cortical cell death that facilitates oxygen diffusion from the shoot to the root tips. Previously, we showed that RBOHH is indispensable for the induction of aerenchyma formation in rice (Oryza sativa) roots under low-oxygen conditions. Here, we showed that CDPK5 and CDPK13 localize to the plasma membrane where RBOHH functions. Mutation analysis of the serine at residues 92 and 107 of RBOHH revealed that these residues are required for CDPK5- and CDPK13-mediated activation of ROS production. The requirement of Ca2+ for CDPK5 and CDPK13 function was confirmed using in vitro kinase assays. CRISPR/Cas9-based mutagenesis of CDPK5 and/or CDPK13 revealed that the double knockout almost completely suppressed inducible aerenchyma formation, whereas the effects were limited in the single knockout of either CDPK5 or CDPK13. Interestingly, the double knockout almost suppressed the induction of adventitious root formation, which is widely conserved in vascular plants, under low-oxygen conditions. Our results suggest that CDPKs are essential for the acclimation of rice to low-oxygen conditions, and also for many other plant species conserving CDPK-targeted phosphorylation sites in RBOH homologues.