A proposed treatment for malaria is a combination of fosmidomycin and clindamycin. Both compounds inhibit the methylerythritol 4-phosphate (MEP) pathway, the parasitic source of farnesyl and geranylgeranyl pyrophosphate (FPP and GGPP, respectively). Both FPP and GGPP are crucial for the biosynthesis of several essential metabolites such as ubiquinone and dolichol, as well as for protein prenylation. Dietary prenols, such as farnesol (FOH) and geranylgeraniol (GGOH), can rescue parasites from MEP inhibitors, suggesting the existence of a missing pathway for prenol salvage via phosphorylation. In this study, we identified a gene in the genome of P . falciparum , encoding a transmembrane prenol kinase (PolK) involved in the salvage of FOH and GGOH. The enzyme was expressed in Saccharomyces cerevisiae , and its FOH/GGOH kinase activities were experimentally validated. Furthermore, conditional knockout parasites (Δ-PolK) were created to investigate the biological importance of the FOH/GGOH salvage pathway. Δ-PolK parasites were viable but displayed increased susceptibility to fosmidomycin. Their sensitivity to MEP inhibitors could not be rescued by adding prenols. Additionally, Δ-PolK parasites lost their capability to utilize prenols for protein prenylation. Experiments using culture medium supplemented with whole/delipidated human plasma in transgenic parasites revealed that human plasma has components that can diminish the effectiveness of fosmidomycin. Mass spectrometry tests indicated that both bovine supplements used in culture and human plasma contain GGOH. These findings suggest that the FOH/GGOH salvage pathway might offer an alternate source of isoprenoids for malaria parasites when de novo biosynthesis is inhibited. This study also identifies a novel kind of enzyme related to isoprenoid metabolism.

The worldwide COVID-19 pandemic caused by the coronavirus SARS-CoV-2 urgently demands novel direct antiviral treatments. The main protease (Mpro) and papain-like protease (PLpro) are attractive drug targets among coronaviruses due to their essential role in processing the polyproteins translated from the viral RNA. In the present work, we virtually screened 688 naphthoquinoidal compounds and derivatives against Mpro of SARS-CoV-2. Twenty-four derivatives were selected and evaluated in biochemical assays against Mpro using a novel fluorogenic substrate. In parallel, these compounds were also assayed with SARS-CoV-2 PLpro. Four compounds inhibited Mpro with half-maximal inhibitory concentration (IC 50 ) values between 0.41 µM and 66 µM. In addition, eight compounds inhibited PLpro with IC 50 ranging from 1.7 µM to 46 µM. Molecular dynamics simulations suggest stable binding modes for Mpro inhibitors with frequent interactions with residues in the S1 and S2 pockets of the active site. For two PLpro inhibitors, interactions occur in the S3 and S4 pockets. In summary, our structure-based computational and biochemical approach identified novel naphthoquinonal scaffolds that can be further explored as SARS-CoV-2 antivirals.

ABSTRACT Salt-inducible kinases (SIKs) are key metabolic regulators. Imbalance of SIK function is associated with the development of diverse cancers, including breast, gastric and ovarian cancer. Chemical tools to clarify the roles of SIK in different diseases are, however, sparse and are generally characterized by poor kinome-wide selectivity. Here, we have adapted the pyrido[2,3- d ]pyrimidin-7-one-based PAK inhibitor G-5555 for the targeting of SIK, by exploiting differences in the back-pocket region of these kinases. Optimization was supported by high-resolution crystal structures of G-5555 bound to the known off-targets MST3 and MST4, leading to a chemical probe, MRIA9, with dual SIK/PAK activity and excellent selectivity over other kinases. Furthermore, we show that MRIA9 sensitizes ovarian cancer cells to treatment with the mitotic agent paclitaxel, confirming earlier data from genetic knockdown studies and suggesting a combination therapy with SIK inhibitors and paclitaxel for the treatment of paclitaxel-resistant ovarian cancer.

Abstract The expression of virulence factors essential for the invasion of host cells by Salmonella enterica is tightly controlled by a network of transcription regulators. The AraC/XylS transcription factor HilD is the main integration point of environmental signals into this regulatory network, with many factors affecting HilD activity. Long chain fatty acids (LCFAs), which are highly abundant throughout the host intestine directly bind to, and repress HilD, acting as environmental cues to coordinate virulence gene expression. The regulatory protein HilE also negatively regulates HilD activity, through a protein-protein interaction. Both of these regulators inhibit HilD dimerisation, preventing HilD from binding to target DNA. We investigated the structural basis of these mechanisms of HilD repression. LCFAs bind to a conserved pocket in HilD, in a comparable manner to that reported for other AraC/XylS regulators, whereas HilE forms a stable heterodimer with HilD by binding to the HilD dimerisation interface. Our results highlight two distinct mechanisms by which HilD activity is repressed, which could be exploited for the development of new antivirulence leads.

ABSTRACT Salt-inducible kinases 1-3 (SIK1-3) are key regulators of the LKB1-AMPK pathway and play an important role in cellular homeostasis. Dysregulation of any of the three isoforms has been associated with tumorigenesis in liver, breast, and ovarian cancers. We have recently developed the dual pan-SIK/group I p21-activated kinase (PAK) chemical probe MRIA9. However, inhibition of p21-activated kinases has been associated with cardiotoxicity in vivo , which complicates the use of MRIA9 as a tool compound. Here, we present a structure-based approach involving the back-pocket and gatekeeper residues, for narrowing the selectivity of pyrido[2,3-d]pyrimidin-7(8 H )-one-based inhibitors towards SIK kinases, eliminating PAK activity. Optimization was guided by high-resolution crystal structure analysis and computational methods, resulting in a pan-SIK inhibitor, MR22, which no longer exhibited activity on STE group kinases and displayed excellent selectivity in a representative kinase panel. MR22-dependent SIK inhibition led to centrosome dissociation and subsequent cell-cycle arrest in ovarian cancer cells, as observed with MRIA9, conclusively linking these phenotypic effects to SIK inhibition. Taken together, MR22 represents a valuable tool compound for studying SIK kinase function in cells.

Abstract A promising treatment for malaria is a combination of fosmidomycin and clindamycin. Both compounds inhibit the methylerythritol 4-phosphate (MEP) pathway, the parasitic source of farnesyl and geranylgeranyl pyrophosphate (FPP and GGPP, respectively). Both FPP and GGPP are crucial for the biosynthesis of several essential metabolites such as ubiquinone and dolichol, as well as for protein prenylation. Dietary prenols, such as farnesol (FOH) and geranylgeraniol (GGOH), can rescue parasites from MEP inhibitors, suggesting the existence of a missing pathway for prenol salvage via phosphorylation, by competition. In this study, we identified a gene in the genome of P. falciparum , encoding a transmembrane prenol kinase (PolK) involved in the salvage of FOH and GGOH. The enzyme was expressed in Saccharomyces cerevisiae , and its FOH/GGOH kinase activities were experimentally validated. Furthermore, conditional gene knockouts were created to investigate the biological importance of the FOH/GGOH salvage pathway. The knockout parasites were viable but more susceptible to fosmidomycin, and their sensitivity to MEP inhibitors could not be rescued by the addition of prenols. Moreover, the knockout parasites lost their ability to use prenols for protein prenylation. These results demonstrate that FOH/GGOH salvage is an additional source of isoprenoids by malaria parasites when de novo biosynthesis is inhibited. This study also identifies a novel kind of enzyme whose inhibition may potentiate the antimalarial efficacy of drugs that affect isoprenoid metabolism.

Mammalian STE20-like (MST) kinases 1-4 play key roles in regulating the Hippo and autophagy pathways, and their dysregulation has been implicated in cancer development. In contrast to the well-studied MST1/2, the roles of MST3/4 are less clear, in part due to the lack of potent and selective MST3/4 inhibitors. Here, we re-evaluated literature compounds, and used structure-guided design to optimize the p21-activated kinase (PAK) inhibitor G-5555 (8) to selectively target MST3/4. These efforts resulted in the development of MR24 (24) and MR30 (27) with good kinome-wide selectivity, high potency for MST3/4, and selectivity towards the closely related MST1/2. In combination with the MST1/2 inhibitor PF-06447475 (2) the two MST3/4 inhibitors can be used to elucidate the multiple roles of MST kinases in cells. We found that MST3/4-selective inhibition caused a cell cycle arrest in the G1 phase, while MST1/2 inhibition resulted in accumulation of cells in the G2/M phase. These data point to distinct functions of these closely related kinases, which can now be addressed with subfamily-selective chemical tool compounds.

The proteasome is essential for eukaryotic cell proteostasis, and inhibitors of the 20S proteasome are progressing preclinically and clinically as antiparasitics. We screenedTrypanosoma brucei, the causative agent of human and animal African trypanosomiasis, in vitro with a set of 27 carmaphycin B analogs, irreversible epoxyketone inhibitors that were originally developed to inhibit thePlasmodium falciparum20S (Pf20S). The structure–activity relationship was distinct from that of the human c20S antitarget by the acceptance of d-amino acids at the P3 position of the peptidyl backbone to yield compounds with greatly decreased toxicity to human cells. For the three most selective compounds, binding to the Tb20S β5 catalytic subunit was confirmed by competition with a fluorescent activity-based probe. For one compound, J-80, with its P3 d-configuration, the differential binding to the parasite's β5 subunit was supported by both covalent and noncovalent docking analysis. Further, J-80 was equipotent against both Trypanosoma brucei gambiense and Trypanosoma brucei rhodesiense in vitro. In a mouse model of Stage 1 T. brucei infection, a single intraperitoneal (i.p.) dose of 40 mg/kg J-80 halted the growth of the parasite, and when given at 50 mg/kg i.p. twice daily for 5 days, parasitemia was decreased to below the detectable limit, with parasite recrudescence 48 h after the last dose. The in vivo proof of principle demonstrated by a potent, selective, and irreversible inhibitor of Tb20S reveals an alternative path to the development of kinetoplastid proteasome inhibitors that differs from the current focus on allosteric reversible inhibitors.

An optimization of the pyridylpiperazine series against Plasmodium falciparum has been performed, exploring a structure-activity relationship carried out on the toluyl fragment of hit 1, a compound with low micromolar activity against Plasmodium falciparum discovered by high-throughput screening. After confirming the crucial role played by this aryl fragment in the antiplasmodial activity, the replacement of the ortho-methyl substituent of 1 by halogenated ones led to an improvement for four analogs, either in terms of potency, expected pharmacokinetics profile, or both. Further introduction of endocyclic nitrogens in this fragment identified two more optimized compounds, 20 and 23, which are expected to be much more metabolically stable than 1. Additional assessment of the cytotoxicity, Ligand Lipophilic Efficiency, potency against the chloroquine-resistant Dd2 strain and in silico ADMET predictions revealed a satisfactory profile for most compounds, ultimately identifying the four optimized compounds 7, 9, 20 and 23 as promising compounds for further lead optimization of this series against Plasmodium falciparum.

The enteric pathogen Salmonella enterica serovar Typhimurium relies on the activity of effector proteins to invade, replicate, and disseminate into host epithelial cells and other tissues, thereby causing disease. Secretion and injection of effector proteins into host cells is mediated by dedicated secretion systems, which hence represent major virulence determinants. Here, we report the identification of a synthetic small molecule with drug-like properties, C26, which suppresses the secretion of effector proteins, and consequently hinders bacterial invasion of eukaryotic cells. C26 binds to and inhibits HilD, the transcriptional regulator of the major secretion systems. While sharing the same binding pocket as the previously described long-chain fatty acid ligands, C26 inhibits HilD with a unique binding mode and a distinct mechanism. We provide evidence for target engagement within infected eukaryotic cells and present analogs with improved potency and suitability as scaffolds to develop anti-virulence agents against Salmonella infections in humans and animals.