JB
Jonathan Backer
Author with expertise in Molecular Mechanisms of Ras Signaling Pathways
Achievements
Cited Author
Open Access Advocate
Key Stats
Upvotes received:
0
Publications:
15
(67% Open Access)
Cited by:
14,087
h-index:
79
/
i10-index:
147
Reputation
Biology
< 1%
Chemistry
< 1%
Economics
< 1%
Show more
How is this calculated?
Publications
0

Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition)

Daniel Klionsky et al.Jan 2, 2016
+101
A
K
D
In 2008 we published the first set of guidelines for standardizing research in autophagy. Since then, research on this topic has continued to accelerate, and many new scientists have entered the field. Our knowledge base and relevant new technologies have also been expanding. Accordingly, it is important to update these guidelines for monitoring autophagy in different organisms. Various reviews have described the range of assays that have been used for this purpose. Nevertheless, there continues to be confusion regarding acceptable methods to measure autophagy, especially in multicellular eukaryotes. For example, a key point that needs to be emphasized is that there is a difference between measurements that monitor the numbers or volume of autophagic elements (e.g., autophagosomes or autolysosomes) at any stage of the autophagic process versus those that measure flux through the autophagy pathway (i.e., the complete process including the amount and rate of cargo sequestered and degraded). In particular, a block in macroautophagy that results in autophagosome accumulation must be differentiated from stimuli that increase autophagic activity, defined as increased autophagy induction coupled with increased delivery to, and degradation within, lysosomes (in most higher eukaryotes and some protists such as Dictyostelium) or the vacuole (in plants and fungi). In other words, it is especially important that investigators new to the field understand that the appearance of more autophagosomes does not necessarily equate with more autophagy. In fact, in many cases, autophagosomes accumulate because of a block in trafficking to lysosomes without a concomitant change in autophagosome biogenesis, whereas an increase in autolysosomes may reflect a reduction in degradative activity. It is worth emphasizing here that lysosomal digestion is a stage of autophagy and evaluating its competence is a crucial part of the evaluation of autophagic flux, or complete autophagy. Here, we present a set of guidelines for the selection and interpretation of methods for use by investigators who aim to examine macroautophagy and related processes, as well as for reviewers who need to provide realistic and reasonable critiques of papers that are focused on these processes. These guidelines are not meant to be a formulaic set of rules, because the appropriate assays depend in part on the question being asked and the system being used. In addition, we emphasize that no individual assay is guaranteed to be the most appropriate one in every situation, and we strongly recommend the use of multiple assays to monitor autophagy. Along these lines, because of the potential for pleiotropic effects due to blocking autophagy through genetic manipulation, it is imperative to target by gene knockout or RNA interference more than one autophagy-related protein. In addition, some individual Atg proteins, or groups of proteins, are involved in other cellular pathways implying that not all Atg proteins can be used as a specific marker for an autophagic process. In these guidelines, we consider these various methods of assessing autophagy and what information can, or cannot, be obtained from them. Finally, by discussing the merits and limits of particular assays, we hope to encourage technical innovation in the field.
0

Structure of the insulin receptor substrate IRS-1 defines a unique signal transduction protein

Xiao Sun et al.Jul 1, 1991
+6
C
P
X
0

Phosphatidylinositol 3′-kinase is activated by association with IRS-1 during insulin stimulation.

Jonathan Backer et al.Sep 1, 1992
+7
S
M
J
Research Article1 September 1992free access Phosphatidylinositol 3′-kinase is activated by association with IRS-1 during insulin stimulation. J.M. Backer J.M. Backer Joslin Diabetes Center, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA. Search for more papers by this author M.G. Myers Jr M.G. Myers Jr Joslin Diabetes Center, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA. Search for more papers by this author S.E. Shoelson S.E. Shoelson Joslin Diabetes Center, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA. Search for more papers by this author D.J. Chin D.J. Chin Joslin Diabetes Center, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA. Search for more papers by this author X.J. Sun X.J. Sun Joslin Diabetes Center, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA. Search for more papers by this author M. Miralpeix M. Miralpeix Joslin Diabetes Center, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA. Search for more papers by this author P. Hu P. Hu Joslin Diabetes Center, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA. Search for more papers by this author B. Margolis B. Margolis Joslin Diabetes Center, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA. Search for more papers by this author E.Y. Skolnik E.Y. Skolnik Joslin Diabetes Center, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA. Search for more papers by this author J. Schlessinger J. Schlessinger Joslin Diabetes Center, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA. Search for more papers by this author J.M. Backer J.M. Backer Joslin Diabetes Center, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA. Search for more papers by this author M.G. Myers Jr M.G. Myers Jr Joslin Diabetes Center, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA. Search for more papers by this author S.E. Shoelson S.E. Shoelson Joslin Diabetes Center, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA. Search for more papers by this author D.J. Chin D.J. Chin Joslin Diabetes Center, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA. Search for more papers by this author X.J. Sun X.J. Sun Joslin Diabetes Center, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA. Search for more papers by this author M. Miralpeix M. Miralpeix Joslin Diabetes Center, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA. Search for more papers by this author P. Hu P. Hu Joslin Diabetes Center, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA. Search for more papers by this author B. Margolis B. Margolis Joslin Diabetes Center, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA. Search for more papers by this author E.Y. Skolnik E.Y. Skolnik Joslin Diabetes Center, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA. Search for more papers by this author J. Schlessinger J. Schlessinger Joslin Diabetes Center, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA. Search for more papers by this author Author Information J.M. Backer1, M.G. Myers1, S.E. Shoelson1, D.J. Chin1, X.J. Sun1, M. Miralpeix1, P. Hu1, B. Margolis1, E.Y. Skolnik1 and J. Schlessinger1 1Joslin Diabetes Center, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA. The EMBO Journal (1992)11:3469-3479https://doi.org/10.1002/j.1460-2075.1992.tb05426.x PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info IRS-1 undergoes rapid tyrosine phosphorylation during insulin stimulation and forms a stable complex containing the 85 kDa subunit (p85) of the phosphatidylinositol (PtdIns) 3′-kinase, but p85 is not tyrosyl phosphorylated. IRS-1 contains nine tyrosine phosphorylation sites in YXXM (Tyr-Xxx-Xxx-Met) motifs. Formation of the IRS-1-PtdIns 3′-kinase complex in vitro is inhibited by synthetic peptides containing phosphorylated YXXM motifs, suggesting that the binding of PtdIns 3′-kinase to IRS-1 is mediated through the SH2 (src homology-2) domains of p85. Furthermore, overexpression of IRS-1 potentiates the activation of PtdIns 3-kinase in insulin-stimulated cells, and tyrosyl phosphorylated IRS-1 or peptides containing phosphorylated YXXM motifs activate PtdIns 3′-kinase in vitro. We conclude that the binding of tyrosyl phosphorylated IRS-1 to the SH2 domains of p85 is the critical step that activates PtdIns 3′-kinase during insulin stimulation. Previous ArticleNext Article Volume 11Issue 91 September 1992In this issue RelatedDetailsLoading ...
0
Paper
Citation1,026
0
Save
0

Amino acids mediate mTOR/raptor signaling through activation of class 3 phosphatidylinositol 3OH-kinase

Takahiro Nobukuni et al.Sep 21, 2005
+9
M
M
T
During the evolution of metazoans and the rise of systemic hormonal regulation, the insulin-controlled class 1 phosphatidylinositol 3OH-kinase (PI3K) pathway was merged with the primordial amino acid-driven mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway to control the growth and development of the organism. Insulin regulates mTOR function through a recently described canonical signaling pathway, which is initiated by the activation of class 1 PI3K. However, how the amino acid input is integrated with that of the insulin signaling pathway is unclear. Here we used a number of molecular, biochemical, and pharmacological approaches to address this issue. Unexpectedly, we found that a major pathway by which amino acids control mTOR signaling is distinct from that of insulin and that, instead of signaling through components of the insulin/class 1 PI3K pathway, amino acids mediate mTOR activation by signaling through class 3 PI3K, hVps34.
0

The SH2/SH3 domain-containing protein GRB2 interacts with tyrosine-phosphorylated IRS1 and Shc: implications for insulin control of ras signalling.

E. Skolnik et al.May 1, 1993
+7
A
C
E
Research Article1 May 1993free access The SH2/SH3 domain-containing protein GRB2 interacts with tyrosine-phosphorylated IRS1 and Shc: implications for insulin control of ras signalling. E.Y. Skolnik E.Y. Skolnik New York University Medical Center, Department of Pharmacology, NY 10016. Search for more papers by this author C.H. Lee C.H. Lee New York University Medical Center, Department of Pharmacology, NY 10016. Search for more papers by this author A. Batzer A. Batzer New York University Medical Center, Department of Pharmacology, NY 10016. Search for more papers by this author L.M. Vicentini L.M. Vicentini New York University Medical Center, Department of Pharmacology, NY 10016. Search for more papers by this author M. Zhou M. Zhou New York University Medical Center, Department of Pharmacology, NY 10016. Search for more papers by this author R. Daly R. Daly New York University Medical Center, Department of Pharmacology, NY 10016. Search for more papers by this author M.J. Myers Jr M.J. Myers Jr New York University Medical Center, Department of Pharmacology, NY 10016. Search for more papers by this author J.M. Backer J.M. Backer New York University Medical Center, Department of Pharmacology, NY 10016. Search for more papers by this author A. Ullrich A. Ullrich New York University Medical Center, Department of Pharmacology, NY 10016. Search for more papers by this author M.F. White M.F. White New York University Medical Center, Department of Pharmacology, NY 10016. Search for more papers by this author E.Y. Skolnik E.Y. Skolnik New York University Medical Center, Department of Pharmacology, NY 10016. Search for more papers by this author C.H. Lee C.H. Lee New York University Medical Center, Department of Pharmacology, NY 10016. Search for more papers by this author A. Batzer A. Batzer New York University Medical Center, Department of Pharmacology, NY 10016. Search for more papers by this author L.M. Vicentini L.M. Vicentini New York University Medical Center, Department of Pharmacology, NY 10016. Search for more papers by this author M. Zhou M. Zhou New York University Medical Center, Department of Pharmacology, NY 10016. Search for more papers by this author R. Daly R. Daly New York University Medical Center, Department of Pharmacology, NY 10016. Search for more papers by this author M.J. Myers Jr M.J. Myers Jr New York University Medical Center, Department of Pharmacology, NY 10016. Search for more papers by this author J.M. Backer J.M. Backer New York University Medical Center, Department of Pharmacology, NY 10016. Search for more papers by this author A. Ullrich A. Ullrich New York University Medical Center, Department of Pharmacology, NY 10016. Search for more papers by this author M.F. White M.F. White New York University Medical Center, Department of Pharmacology, NY 10016. Search for more papers by this author Author Information E.Y. Skolnik1, C.H. Lee1, A. Batzer1, L.M. Vicentini1, M. Zhou1, R. Daly1, M.J. Myers1, J.M. Backer1, A. Ullrich1 and M.F. White1 1New York University Medical Center, Department of Pharmacology, NY 10016. The EMBO Journal (1993)12:1929-1936https://doi.org/10.1002/j.1460-2075.1993.tb05842.x PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info GRB2, a small protein comprising one SH2 domain and two SH3 domains, represents the human homologue of the Caenorhabditis elegans protein, sem-5. Both GRB2 and sem-5 have been implicated in a highly conserved mechanism that regulates p21ras signalling by receptor tyrosine kinases. In this report we show that in response to insulin, GRB2 forms a stable complex with two tyrosine-phosphorylated proteins. One protein is the major insulin receptor substrate IRS-1 and the second is the SH2 domain-containing oncogenic protein, Shc. The interactions between GRB2 and these two proteins require ligand activation of the insulin receptor and are mediated by the binding of the SH2 domain of GRB2 to phosphotyrosines on both IRS-1 and Shc. Although GRB2 associates with IRS-1 and Shc, it is not tyrosine-phosphorylated after insulin stimulation, implying that GRB2 is not a substrate for the insulin receptor. Furthermore, we have identified a short sequence motif (YV/IN) present in IRS-1, EGFR and Shc, which specifically binds the SH2 domain of GRB2 with high affinity. Interestingly, both GRB2 and phosphatidylinositol-3 (PI-3) kinase can simultaneously bind distinct tyrosine phosphorylated regions on the same IRS-1 molecule, suggesting a mechanism whereby IRS-1 could provide the core for a large signalling complex. We propose a model whereby insulin stimulation leads to formation of multiple protein--protein interactions between GRB2 and the two targets IRS-1 and Shc. These interactions may play a crucial role in activation of p21ras and the control of downstream effector molecules. Previous ArticleNext Article Volume 12Issue 51 May 1993In this issue RelatedDetailsLoading ...
0

Phosphatidylinositol-3-OH kinases are Rab5 effectors

Savvas Christoforidis et al.Jul 15, 1999
+6
K
M
S
0

Role of phosphatidylinositol 3-kinase and Rab5 effectors in phagosomal biogenesis and mycobacterial phagosome maturation arrest

Rutilio Fratti et al.Aug 6, 2001
+2
J
J
R
Phagosomal biogenesis is a fundamental biological process of particular significance for the function of phagocytic and antigen-presenting cells. The precise mechanisms governing maturation of phagosomes into phagolysosomes are not completely understood. Here, we applied the property of pathogenic mycobacteria to cause phagosome maturation arrest in infected macrophages as a tool to dissect critical steps in phagosomal biogenesis. We report the requirement for 3-phosphoinositides and acquisition of Rab5 effector early endosome autoantigen (EEA1) as essential molecular events necessary for phagosomal maturation. Unlike the model phagosomes containing latex beads, which transiently recruited EEA1, mycobacterial phagosomes excluded this regulator of vesicular trafficking that controls membrane tethering and fusion processes within the endosomal pathway and is recruited to endosomal membranes via binding to phosphatidylinositol 3-phosphate (PtdIns[3]P). Inhibitors of phosphatidylinositol 3′(OH)-kinase (PI-3K) activity diminished EEA1 recruitment to newly formed latex bead phagosomes and blocked phagosomal acquisition of late endocytic properties, indicating that generation of PtdIns(3)P plays a role in phagosomal maturation. Microinjection into macrophages of antibodies against EEA1 and the PI-3K hVPS34 reduced acquisition of late endocytic markers by latex bead phagosomes, demonstrating an essential role of these Rab5 effectors in phagosomal biogenesis. The mechanism of EEA1 exclusion from mycobacterial phagosomes was investigated using mycobacterial products. Coating of latex beads with the major mycobacterial cell envelope glycosylated phosphatidylinositol lipoarabinomannan isolated from the virulent Mycobacterium tuberculosis H37Rv, inhibited recruitment of EEA1 to latex bead phagosomes, and diminished their maturation. These findings define the generation of phosphatidylinositol 3-phosphate and EEA1 recruitment as: (a) important regulatory events in phagosomal maturation and (b) critical molecular targets affected by M. tuberculosis. This study also identifies mycobacterial phosphoinositides as products with specialized toxic properties, interfering with discrete trafficking stages in phagosomal maturation.
0

Distinct roles of class I and class III phosphatidylinositol 3-kinases in phagosome formation and maturation

Otília Vieira et al.Oct 1, 2001
+7
L
R
O
Phagosomes acquire their microbicidal properties by fusion with lysosomes. Products of phosphatidylinositol 3-kinase (PI 3-kinase) are required for phagosome formation, but their role in maturation is unknown. Using chimeric fluorescent proteins encoding tandem FYVE domains, we found that phosphatidylinositol 3-phosphate (PI[3]P) accumulates greatly but transiently on the phagosomal membrane. Unlike the 3′-phosphoinositides generated by class I PI 3-kinases which are evident in the nascent phagosomal cup, PI(3)P is only detectable after the phagosome has sealed. The class III PI 3-kinase VPS34 was found to be responsible for PI(3)P synthesis and essential for phagolysosome formation. In contrast, selective ablation of class I PI 3-kinase revealed that optimal phagocytosis, but not maturation, requires this type of enzyme. These results highlight the differential functional role of the two families of kinases, and raise the possibility that PI(3)P production by VPS34 may be targeted during the maturation arrest induced by some intracellular parasites.
0

hVps34 Is a Nutrient-regulated Lipid Kinase Required for Activation of p70 S6 Kinase

Maya Byfield et al.Jul 28, 2005
J
J
M
Mammalian cells respond to nutrient deprivation by inhibiting energy consuming processes, such as proliferation and protein synthesis, and by stimulating catabolic processes, such as autophagy. p70 S6 kinase (S6K1) plays a central role during nutritional regulation of translation. S6K1 is activated by growth factors such as insulin, and by mammalian target of rapamycin (mTOR), which is itself regulated by amino acids. The Class IA phosphatidylinositol (PI) 3-kinase plays a well recognized role in the regulation of S6K1. We now present evidence that the Class III PI 3-kinase, hVps34, also regulates S6K1, and is a critical component of the nutrient sensing apparatus. Overexpression of hVps34 or the associated hVps15 kinase activates S6K1, and insulin stimulation of S6K1 is blocked by microinjection of inhibitory anti-hVps34 antibodies, overexpression of a FYVE domain construct that sequesters the hVps34 product PI3P, or small interfering RNA-mediated knock-down of hVps34. hVps34 is not part of the insulin input to S6K1, as it is not stimulated by insulin, and inhibition of hVps34 has no effect on phosphorylation of Akt or TSC2 in insulin-stimulated cells. However, hVps34 is inhibited by amino acid or glucose starvation, suggesting that it lies on the nutrient-regulated pathway to S6K1. Consistent with this, hVps34 is also inhibited by activation of the AMP-activated kinase, which inhibits mTOR/S6K1 in glucose-starved cells. hVps34 appears to lie upstream of mTOR, as small interfering RNA knock-down of hVps34 inhibits the phosphorylation of another mTOR substrate, eIF4E-binding protein-1 (4EBP1). Our data suggest that hVps34 is a nutrient-regulated lipid kinase that integrates amino acid and glucose inputs to mTOR and S6K1.
0

Regulation of the p85/p110 Phosphatidylinositol 3′-Kinase: Stabilization and Inhibition of the p110α Catalytic Subunit by the p85 Regulatory Subunit

Jinghua Yu et al.Mar 1, 1998
+3
J
Y
J
We propose a novel model for the regulation of the p85/p110␣ phosphatidylinositol 3-kinase.In insect cells, the p110␣ catalytic subunit is active as a monomer but its activity is decreased by coexpression with the p85 regulatory subunit.Similarly, the lipid kinase activity of recombinant glutathione S-transferase (GST)-p110␣ is reduced by 65 to 85% upon in vitro reconstitution with p85.Incubation of p110␣/p85 dimers with phosphotyrosyl peptides restored activity, but only to the level of monomeric p110␣.These data show that the binding of phosphoproteins to the SH2 domains of p85 activates the p85/p110␣ dimers by inducing a transition from an inhibited to a disinhibited state.In contrast, monomeric p110 had little activity in HEK 293T cells, and its activity was increased 15-to 20-fold by coexpression with p85.However, this apparent requirement for p85 was eliminated by the addition of a bulky tag to the N terminus of p110␣ or by the growth of the HEK 293T cells at 30°C.These nonspecific interventions mimicked the effects of p85 on p110␣, suggesting that the regulatory subunit acts by stabilizing the overall conformation of the catalytic subunit rather than by inducing a specific activated conformation.This stabilization was directly demonstrated in metabolically labeled HEK 293T cells, in which p85 increased the half-life of p110.Furthermore, p85 protected p110 from thermal inactivation in vitro.Importantly, when we examined the effect of p85 on GST-p110␣ in mammalian cells at 30°C, culture conditions that stabilize the catalytic subunit and that are similar to the conditions used for insect cells, we found that p85 inhibited p110␣.Thus, we have experimentally distinguished two effects of p85 on p110␣: conformational stabilization of the catalytic subunit and inhibition of its lipid kinase activity.Our data reconcile the apparent conflict between previous studies of insect versus mammalian cells and show that p110␣ is both stabilized and inhibited by dimerization with p85.
Load More