Pneumolysin (PLY) is a key Streptococcus pneumoniae virulence factor and potential candidate for inclusion in pneumococcal subunit vaccines. Dendritic cells (DC) play a key role in the initiation and instruction of adaptive immunity, but the effects of PLY on DC have not been widely investigated. Endotoxin-free PLY enhanced costimulatory molecule expression on DC but did not induce cytokine secretion. These effects have functional significance as adoptive transfer of DC exposed to PLY and antigen resulted in stronger antigen-specific T cell proliferation than transfer of DC exposed to antigen alone. PLY synergized with TLR agonists to enhance secretion of the proinflammatory cytokines IL-12, IL-23, IL-6, IL-1β, IL-1α and TNF-α by DC and enhanced cytokines including IL-17A and IFN-γ by splenocytes. PLY-induced DC maturation and cytokine secretion by DC and splenocytes was TLR4-independent. Both IL-17A and IFN-γ are required for protective immunity to pneumococcal infection and intranasal infection of mice with PLY-deficient pneumococci induced significantly less IFN-γ and IL-17A in the lungs compared to infection with wild-type bacteria. IL-1β plays a key role in promoting IL-17A and was previously shown to mediate protection against pneumococcal infection. The enhancement of IL-1β secretion by whole live S. pneumoniae and by PLY in DC required NLRP3, identifying PLY as a novel NLRP3 inflammasome activator. Furthermore, NLRP3 was required for protective immunity against respiratory infection with S. pneumoniae. These results add significantly to our understanding of the interactions between PLY and the immune system.

Abstract Although neutrophils are the most abundant cells in acute infection and inflammation, relatively little attention has been paid to their role in inflammasome formation and IL-1β processing. In the present study, we investigated the mechanism by which neutrophils process IL-1β in response to Streptococcus pneumoniae. Using a murine model of S. pneumoniae corneal infection, we demonstrated a requirement for IL-1β in bacterial clearance, and we showed that Nod-like receptor protein 3 (NLRP3), apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain (ASC), and caspase-1 are essential for IL-1β production and bacterial killing in the cornea. Neutrophils in infected corneas had multiple specks with enzymatically active caspase-1 (YVAD-FLICA 660), and bone marrow neutrophils stimulated with heat-killed S. pneumoniae (signal 1) and pneumolysin (signal 2) exhibited multiple specks when stained for NLRP3, ASC, or Caspase-1. High–molecular mass ASC complexes were also detected, consistent with oligomer formation. Pneumolysin induced K+ efflux in neutrophils, and blocking K+ efflux inhibited caspase-1 activation and IL-1β processing; however, neutrophils did not undergo pyroptosis, indicating that K+ efflux and IL-1β processing is not a consequence of cell death. There was also no role for lysosomal destabilization or neutrophil elastase in pneumolysin-mediated IL-1β processing in neutrophils. Taken together, these findings demonstrate an essential role for neutrophil-derived IL-1β in S. pneumoniae infection, and they elucidate the role of the NLRP3 inflammasome in cleavage and secretion of IL-1β in neutrophils. Given the ubiquitous presence of neutrophils in acute bacterial and fungal infections, these findings will have implications for other microbial diseases.

Streptococcus agalactiae (or Group B Streptococcus, GBS) is a leading cause of neonatal sepsis and meningitis globally. To sense and respond to variations in its environment, GBS possesses multiple two-component regulatory systems (TCSs) such as LytSR. Here, we aimed to investigate the role of LytSR in GBS pathogenicity. We generated an isogenic lytS knockout mutant in a clinical GBS isolate and used a combination of phenotypic in vitro assays and in vivo murine models to investigate the contribution of lytS to the colonisation and invasive properties of GBS. Deletion of the lytS gene in the GBS chromosome resulted in significantly higher survival rates in mice during sepsis, accompanied by reduced bacterial loads in blood, lung, spleen, kidney and brain tissue compared to infection with the wild-type strain. In a mouse model of GBS vaginal colonisation, we also observed that the lytS knockout mutant was cleared more readily from the vaginal tract compared to its wild-type counterpart. Interestingly, lower levels of proinflammatory cytokines were found in the serum of mice infected with the lytS mutant. Our results demonstrate that the LytSR TCS plays a key role in GBS tissue invasion and pathogenesis, and persistence of mucosal colonisation.

Abstract Pseudomonas aeruginosa undergoes diversification during infection of the cystic fibrosis (CF) lung. Understanding these changes requires model systems that capture the complexity of the CF lung environment. We previously identified loss-of-function mutations in the two-component regulatory system sensor kinase gene pmrB , in P. aeruginosa from CF and from experimental infection of mice. Here, we demonstrate that whilst such mutations lower in vitro MICs for multiple antimicrobial classes, this is not reflected in increased antibiotic susceptibility in vivo . Loss of PmrB impairs aminoarabinose modification of lipopolysaccharide, increasing the negative charge of the outer membrane and promoting uptake of cationic antimicrobials. However, in vivo , this can be offset by increased membrane binding of other positively charged molecules present in lungs. The polyamine spermidine readily coats the surface of PmrB - deficient P. aeruginosa , reducing susceptibility to antibiotics that rely on charge differences to bind the outer membrane and increasing biofilm formation. Spermidine is elevated in lungs during P. aeruginosa infection in mice and during episodes of antimicrobial treatment in people with CF. These findings highlight the need to study antimicrobial resistance under clinically relevant environmental conditions. Microbial mutations carrying fitness costs in vitro may be advantageous during infection, where host resources can be utilised.

To better understand Streptococcus pneumoniae pathogenesis we performed RNA sequencing on cerebrospinal fluid (CSF) from meningitis patients to identify bacterial genes expressed during invasion of the central nervous system. Comparison to transcriptome data for serotype 1 S. pneumoniae cultured in ex vivo human CSF defined a subset of 57 genes with high expression during human meningitis. Deletion of two of the most highly expressed genetic loci, bgaA (encodes for a beta-galactosidase) or the SP_1801-5 putative stress response operon, resulted in S. pneumoniae strains still able to transmigrate the blood brain barrier but which were more susceptible to complement opsonisation and unable to maintain brain infection in a murine meningitis model. In 1144 meningitis patients, infection with bgaA containing S. pneumoniae strains was associated with a higher mortality (22% versus 14% p=0.02). These data demonstrate that direct bacterial RNAseq from CSF can identify previously undescribed S. pneumoniae virulence factors required for meningitis pathogenesis.

Abstract Streptococcus pneumoniae serotype 1 is a major cause of invasive pneumococcal disease. Despite its high attack rate, serotype 1 exhibits a low carriage prevalence within the population, which raises important questions about the relationship between carriage and transmission of hypervirulent pneumococcal strains between individuals. We compared the transmission dynamics of serotype 1 sequence type ST217 to serotype 2 strain D39 using a novel model of transmission in young adult mice. Donor index mice were intranasally infected with ST217, D39 or isogenic pneumolysin-deficient mutants and co-housed with recipient naive contact mice. Three days later, all mice were infected with influenza A virus (IAV). Pneumococcal transmission was analysed during colonisation alone and co-infection with IAV by quantification of shedding and nasal colonisation in index and contact mice. The role of the toxin pneumolysin in shedding, transmission and colonisation, and the host nasopharyngeal immune response were investigated. We show that ST217 was shed in index mice at significantly greater levels compared to D39. Upon viral co-infection, ST217 was shed and transmitted at a faster rate to contact mice and displayed higher transmission levels compared to D39. Interestingly, the toxin pneumolysin did not play a role in shedding. However, upon acquisition by contact mice, pneumolysin-dependent macrophage recruitment was observed in the nasopharynx. Our results show that the rapid and high transmission rate of serotype 1 is a key factor in its ability to disseminate quickly within the population and cause disease outbreaks.

Prolonging the clinical effectiveness of β-lactams, which remain first-line antibiotics for many infections, is an important part of efforts to address antimicrobial resistance. We report here that inactivation of the predicted D-cycloserine (DCS) transporter gene cycA re-sensitized MRSA to β-lactam antibiotics. The cycA mutation also resulted in hyper-susceptibility to DCS, an alanine analogue antibiotic that inhibits alanine racemase and D-alanine ligase required for D-alanine incorporation into cell wall peptidoglycan (PG). Alanine transport was impaired in the cycA mutant and this correlated with increased susceptibility to oxacillin and DCS. The cycA mutation or exposure to DCS were both associated with the accumulation of muropeptides with tripeptide stems lacking the terminal D-ala-D-ala and reduced PG crosslinking, prompting us to investigate synergism between β-lactams and DCS. DCS re-sensitised MRSA to β-lactams in vitro and significantly enhanced MRSA eradication by oxacillin in a mouse bacteraemia model. These findings reveal alanine transport as a new therapeutic target to enhance the susceptibility of MRSA to β-lactam antibiotics.

Abstract Staphylococcus aureus nasal colonization is a risk factor for infection. A large proportion of the population are identified as potential S. aureus carriers yet we only partially understand the repertoire of genetic factors that promote long-term nasal colonization. Here we present a novel murine model of nasopharyngeal colonization that requires a low S. aureus inoculum and is amenable to experimental evolution approaches. We used this model to experimentally evolve S. aureus using successive passages in the nasopharynx to identify those genetic loci under selection. After 3 cycles of colonization, mutations were identified in mannitol, sorbitol, arginine, nitrite and lactate metabolism genes promoting key pathways in nasal colonization. Stress responses were identified as being under selective pressure, with mutations in DNA repair genes including dnaJ and recF and key stress response genes clpL, rpoB and ahpF . Peptidoglycan synthesis pathway genes also revealed mutations indicating potential selection for alteration of the cell surface. The infection model used here is versatile to assist decolonization and persistence studies.

Abstract The entry routes and translocation mechanisms of bacterial pathogens into the central nervous system remain obscure. We report here that Streptococcus pneumoniae (Sp) or polystyrene microspheres, applied to the nose of a mouse, appeared in the meninges of the dorsal cortex within minutes. Recovery of viable bacteria from dissected tissue and fluorescence microscopy showed that up to at least 72h, Sp and microspheres were predominantly in the outer of the two meninges, the pachymeninx. No Sp were found in blood or cerebrospinal fluid. Evidence that this was not an artifact of the method of administration is that in mice infected by horizontal transmission, Sp were also predominantly in the meninges and absent from blood. Intravital imaging through the skull, and flow cytometry showed recruitment and activation of LysM + cells in the dorsal pachymeninx at 5h and 10h following intranasal infection. Imaging of the cribriform plate suggested that both Sp and microspheres entered through its foramina via an inward flow of fluid connecting the nose to the pachymeninx. Our findings bring further insight into the invasion mechanisms of bacterial pathogens such as Sp into the central nervous system, but are also pertinent to the delivery of drugs to the brain, and the entry of air-borne particles into the cranium.