ABSTRACT The blood-brain barrier (BBB) is essential to maintain brain homeostasis and healthy conditions but it also prevents drugs from reaching brain cells. In the BBB, tight junctions (TJs) are multi-protein complexes located at the interface between adjacent brain endothelial cells that regulate paracellular diffusion and claudin-5 (CLDN5) is the major component of the TJ portfolio, playing a pivotal role in restricting the paracellular traffic. In view of obtaining fine control over the transport across the BBB, the use of competing peptides able to bind CLDN5 to induce transient and regulated permeabilization of the paracellular passage is emerging as a potentially translatable strategy for clinical applications. In this work, we designed and tested short peptides with improved solubility and biocompatibility using a combined approach that involved structural modeling techniques and in vitro validation, generating a robust workflow for the design, screening, and optimization of peptides for the modulation of the BBB paracellular permeability. We designed a selection of 11- to 16-mer compounds derived from the first CLDN5 extracellular domain and from the CLDN5-binding domain of Clostridium perfringens enterotoxin and determined their efficiency in enhancing BBB permeability. The computational analysis classified all tested peptides based on solubility and affinity to CLDN5, and provided atom-level details of the binding process. From our screening, we identified a novel CLDN5-derived peptide, here called f1-C5C2 , which demonstrated good solubility in biological media, efficient binding to CLDN5 subunits, and capability to increase permeability at low concentrations. The peptidomimetic in silico/in vitro strategy described here can achieve a transient and reversible permeabilization of the BBB with potential applications in the pharmacological treatment of brain diseases. HIGHLIGHTS Water-soluble peptidomimetics are used to competitively bind claudin-5 tight junction proteins and increase the permeability of the blood-brain barrier; Trans-endothelial electrical resistance and dissociation constant measurements demonstrate the binding affinity of the peptide f1-C5C2 for claudin-5; Unbinding free energy calculations correlated with experimental results and provided information on the protein-peptide binding interface. Incubation with the peptide f1-C5C2 allows paracellular transport of 4K, but not 70K, dextran. GRAPHICAL ABSTRACT

ABSTRACT Pathogenic variants in KCNQ2 encoding for Kv7.2 voltage-gated potassium channel subunits cause developmental encephalopathies ( KCNQ2 -encephalopathies), both with and without epilepsy. We herein describe the clinical, in vitro and in silico features of two encephalopathy-causing variants (A317T, L318V) in Kv7.2 affecting two consecutive residues in the S 6 activation gate undergoing large structural rearrangements during pore opening. Currents through these mutant channels displayed increased density, hyperpolarizing shifts in activation gating, and insensitivity to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP 2 ), a critical regulator of Kv7 channel function; all these features are consistent with a strong gain-of-function effect. An increase in single-channel open probability, with no change in membrane abundance or single-channel conductance, was responsible for the observed gain-of-function effects. All-atoms Molecular Dynamics simulations revealed that the mutations widened the inner pore gate and stabilized a constitutively open channel configuration in the closed state, with minimal effects on the open conformation. Thus, a PIP 2 -independent stabilization of the inner pore gate open configuration is a novel molecular pathogenetic mechanism for KCNQ2 -developmental encephalopathies.

ABSTRACT Claudins (Cldns) form a large family of protein homologs that are essential for the assembly of paracellular tight junctions (TJs), where they form channels or barriers with tissue-specific selectivity for permeants. In contrast to several family members whose physiological role has been identified, the function of claudin 4 (Cldn4) remains elusive, despite experimental evidence suggesting that it can form anion-selective TJ channels in the renal epithelium. Computational approaches have recently been employed to elucidate the molecular basis of Cldns’ function, and hence could help in clarifying Cldn4 role. In this work, we use structural modeling and all-atom molecular dynamics simulations to transfer two previously introduced structural models of Cldn-based paracellular complexes to Cldn4, in order to reproduce a paracellular anion channel. Free energy (FE) calculations for ionic transport through the pores allow us to establish the thermodynamic properties driving the ion-selectivity of the structures. While one model shows a cavity permeable to chloride and repulsive to cations, the other forms barrier to the passage of all the major physiological ions. Furthermore, our results confirm the charge selectivity role of the residue Lys65 in the first extracellular loop of the protein, rationalizing Cldn4 control of paracellular permeability.

ABSTRACT The blood-brain barrier (BBB) strictly regulates the exchange of ions and molecules between the blood and the central nervous system. Tight junctions (TJs) are multimeric structures that control the transport through the paracellular spaces between adjacent brain endothelial cells of the BBB. Claudin-5 (Cldn5) proteins are essential for the TJ formation and assemble into multi-protein complexes via cis -interactions within the same cell membrane and trans -interactions across two contiguous cells. Despite the relevant biological function of Cldn5 proteins and their role as targets of brain drug delivery strategies, the molecular details of their assembly within TJs are still unclear. Two different structural models have been recently introduced, in which Cldn5 dimers belonging to opposite cells join to generate paracellular pores. However, a comparison of these models in terms of ionic transport features is still lacking. In this work, we used molecular dynamics simulations and free energy (FE) calculations to assess the two Cldn5 pore models and investigate the thermodynamic properties of water and physiological ions permeating through them. Despite different FE profiles, both structures present single/multiple FE barriers to ionic permeation, while being permissive to water flux. These results reveal that both models are compatible with the physiological role of Cldn5 TJ strands. By identifying the protein-protein surface at the core of TJ Cldn5 assemblies, our computational investigation provides a basis for the rational design of synthetic peptides and other molecules capable of opening paracellular pores in the BBB.

The structural scaffold of epithelial and endothelial tight junctions (TJ) comprises multimeric strands of claudin (Cldn) proteins, which anchor adjacent cells and control the paracellular flux of water and solutes. Based on the permeability properties they confer to the TJs, Cldns are classified as channel- or barrier-forming. Some of them, however, show mixed features. For instance, Cldn10b, expressed in kidneys, lungs, and other tissues, displays high permeability for cations and low permeability for water. Along with its high sequence similarity to the cation- and water-permeable Cldn15, this makes Cldn10b a valuable test case for investigating the molecular determinants of paracellular transport. In lack of high-resolution experimental information on TJ architectures, here we use Molecular Dynamics simulations to study two atomistic models of Cldn10b strands and compare their ion and water transport with those of Cldn15. Our data, based on extensive standard simulations and Free Energy calculations, reveal that both Cldn10b models form cation-permeable pores narrower than Cldn15, which, together with the stable coordination of Na+ ions to acidic pore-lining residues (E153, D36, D56), limit the passage of water molecules. By providing a mechanism driving a peculiar case of paracellular transport, these results provide a structural basis for the specific permeability properties of Cldn isoforms that define their physiological role.

Tight junctions (TJs) are multi-protein complexes at the interface between adjacent endothelial or epithelial cells. In the blood-brain barrier (BBB), they are responsible for sealing the paracellular spaces and their backbone is formed by Claudin-5 (Cldn5) proteins. Despite the important role in preserving brain homeostasis, little is known on how Cldn5 oligomers assemble. Different structural models have been suggested, where Cldn5 protomers from opposite cells associate to generate paracellular pores that do not allow the passage of ions or small molecules. Recently, the first Cldn5 pathogenic mutation, G60R, was identified and shown to induce anion selectivity in the BBB TJs. This offers an excellent opportunity to further assess the structural models. In this work, we performed umbrella sampling molecular dynamics simulations to study the permeation of single Na + , Cl − and H 2 O through two distinct G60R Cldn5 paracellular models. Only one of them, called Pore I, reproduces the functional modification observed in the experiments, displaying a free energy (FE) minimum for Cl − and a barrier for Na + at the central constriction, consistent with the formation of an anionic channel. To further test the validity of the model, we performed the same calculations for the Q57D and the Q63D mutants, which affect two side-chains in the constriction site. In particular, Q57 is conserved among various Cldns, with few exceptions such as the two cation permeable homologs Cldn15 and Cldn10b. In both cases, we obtain that the FE profiles are modified with respect to the wild-type system, facilitating the passage of cations. Our calculations are the first in-silico description of the effect of a Cldn5 pathogenic mutation, and provide a further assessment of the Pore I model for Cldn5-based TJ architectures, yielding new atom-detailed insight on the selective permeability of the paracellular spaces in BBB.

Pathogenic variants in KCNQ2 encoding Kv7.2 voltage-gated potassium channel subunits cause developmental encephalopathies ( KCNQ2 -encephalopathies), both with and without epilepsy. We herein describe the clinical, in vitro, and in silico features of two encephalopathy-causing variants (A317T, L318V) in Kv7.2 affecting two consecutive residues in the S 6 activation gate that undergoes large structural rearrangements during pore opening; the disease-causing A356T variant in KCNQ3 , paralogous to the A317T variant in KCNQ2 , was also investigated. Currents through KCNQ2 mutant channels displayed increased density, hyperpolarizing shifts in activation gating, faster activation and slower deactivation kinetics, and resistance to changes in the cellular concentrations of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP 2 ), a critical regulator of Kv7 channel function; all these features are consistent with a strong gain-of-function effect. An increase in the probability of single-channel opening, with no change in membrane abundance or single-channel conductance, was responsible for the observed gain-of-function effects. All-atom molecular dynamics simulations revealed that the mutations widened the inner pore gate and stabilized a constitutively open channel configuration in the closed state, with minimal effects on the open conformation. Thus, mutation-induced stabilization of the inner pore gate open configuration is a molecular pathogenetic mechanism for KCNQ2 -related encephalopathies.