We report the sequence and analysis of the 814-megabase genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus , a model for developmental and systems biology. The sequencing strategy combined whole-genome shotgun and bacterial artificial chromosome (BAC) sequences. This use of BAC clones, aided by a pooling strategy, overcame difficulties associated with high heterozygosity of the genome. The genome encodes about 23,300 genes, including many previously thought to be vertebrate innovations or known only outside the deuterostomes. This echinoderm genome provides an evolutionary outgroup for the chordates and yields insights into the evolution of deuterostomes.

ABSTRACT β-catenin is thought to mediate cell fate specification events by localizing to the nucleus where it modulates gene expression. To ask whether β-catenin is involved in cell fate specification during sea urchin embryogenesis, we analyzed the distribution of nuclear β-catenin in both normal and experimentally manipulated embryos. In unperturbed embryos, β-catenin accumulates in nuclei that include the precursors of the endoderm and mesoderm, suggesting that it plays a role in vegetal specification. Using pharmacological, embryological and molecular approaches, we determined the function of β-catenin in vegetal development by examining the relationship between the pattern of nuclear β-catenin and the formation of endodermal and mesodermal tissues. Treatment of embryos with LiCl, a known vegetalizing agent, caused both an enhancement in the levels of nuclear β-catenin and an expansion in the pattern of nuclear β-catenin that coincided with an increase in endoderm and mesoderm. Conversely, overexpression of a sea urchin cadherin blocked the accumulation of nuclear β-catenin and consequently inhibited the formation of endodermal and mesodermal tissues including micromere-derived skeletogenic mesenchyme. In addition, nuclear β-catenin-deficient micromeres failed to induce a secondary axis when transplanted to the animal pole of uninjected host embryos, indicating that nuclear β-catenin also plays a role in the production of micromere-derived signals. To examine further the relationship between nuclear β-catenin in vegetal nuclei and micromere signaling, we performed both transplantations and deletions of micromeres at the 16-cell stage and demonstrated that the accumulation of β-catenin in vegetal nuclei does not require micromere-derived cues. Moreover, we demonstrate that cell autonomous signals appear to regulate the pattern of nuclear β-catenin since dissociated blastomeres possessed nuclear β-catenin in approximately the same proportion as that seen in intact embryos. Together, these data show that the accumulation of β-catenin in nuclei of vegetal cells is regulated cell autonomously and that this localization is required for the establishment of all vegetal cell fates and the production of micromere-derived signals.

Cell-substratum adhesion strengths have been quantified using fibroblasts and glioma cells binding to two extracellular matrix proteins, fibronectin and tenascin. A centrifugal force-based adhesion assay was used for the adhesive strength measurements, and the corresponding morphology of the adhesions was visualized by interference reflection microscopy. The initial adhesions as measured at 4 degrees C were on the order of 10(-5)dynes/cell and did not involve the cytoskeleton. Adhesion to fibronectin after 15 min at 37 degrees C were more than an order of magnitude stronger; the strengthening response required cytoskeletal involvement. By contrast to the marked strengthening of adhesion to FN, adhesion to TN was unchanged or weakened after 15 min at 37 degrees C. The absolute strength of adhesion achieved varied according to protein and cell type. When a mixed substratum of fibronectin and tenascin was tested, the presence of tenascin was found to reduce the level of the strengthening of cell adhesion normally observed at 37 degrees C on a substratum of fibronectin alone. Parallel analysis of corresponding interference reflection micrographs showed that differences in the area of cell surface within 10-15 nm of the substratum correlated closely with each of the changes in adhesion observed: after incubation for 15 min on fibronectin at 37 degrees C, glioma cells increased their surface area within close contact to the substrate by integral to 125-fold. Cells on tenascin did not increase their surface area of contact. The increased surface area of contact and the inhibitory activity of cytochalasin b suggest that the adhesive "strengthening" in the 15 min after initial binding brings additional adhesion molecules into the adhesive site and couples the actin cytoskeleton to the adhesion complex.

Using scRNA-seq coupled with computational approaches, we studied transcriptional changes in cell states of sea urchin embryos during development to the larval stage. Eighteen closely spaced time points were taken during the first 24 h of development of Lytechinus variegatus (Lv). Developmental trajectories were constructed using Waddington-OT, a computational approach to 'stitch' together developmental time points. Skeletogenic and primordial germ cell trajectories diverged early in cleavage. Ectodermal progenitors were distinct from other lineages by the 6th cleavage, although a small percentage of ectoderm cells briefly co-expressed endoderm markers that indicated an early ecto-endoderm cell state, likely in cells originating from the equatorial region of the egg. Endomesoderm cells also originated at the 6th cleavage and this state persisted for more than two cleavages, then diverged into distinct endoderm and mesoderm fates asynchronously, with some cells retaining an intermediate specification status until gastrulation. Seventy-nine out of 80 genes (99%) examined, and included in published developmental gene regulatory networks (dGRNs), are present in the Lv-scRNA-seq dataset and are expressed in the correct lineages in which the dGRN circuits operate.

The developmental gene regulatory networks (dGRNs) of two sea urchin species, Lytechinus variegatus (Lv) and Strongylocentrotus purpuratus (Sp), have remained remarkably similar despite about 50 million years since a common ancestor. Hundreds of parallel experimental perturbations of transcription factors with similar outcomes support this conclusion. A recent scRNA-seq analysis suggested that the earliest expression of several genes within the dGRNs differs between Lv and Sp. Here, we present a careful reanalysis of the dGRNs in these two species, paying close attention to timing of first expression. We find that initial expression of genes critical for cell fate specification occurs during several compressed time periods in both species. Previously unrecognized feedback circuits are inferred from the temporally corrected dGRNs. Although many of these feedbacks differ in location within the respective GRNs, the overall number is similar between species. We identify several prominent differences in timing of first expression for key developmental regulatory genes; comparison with a third species indicates that these heterochronies likely originated in an unbiased manner with respect to embryonic cell lineage and evolutionary branch. Together, these results suggest that interactions can evolve even within highly conserved dGRNs and that feedback circuits may buffer the effects of heterochronies in the expression of key regulatory genes.

Abstract Here we employed scRNA-seq coupled with computational approaches to examine molecular changes in cells during specification and differentiation. We examined the first 24 hours of development of the sea urchin Lytechinus variegatus ( Lv ) with 18 time points during which the embryo develops to the larval stage. Using Waddington-OT, the time points were computationally “stitched” together to calculate developmental trajectories. Skeletogenic cells displayed the expected immediate early divergence while other lineages diverged asynchronously, with many cells retaining an intermediate specification status until late in gastrulation. The Lv -scRNA-seq dataset was compared to the developmental Gene Regulatory Network (dGRN) model of specification in Strongylocentrotus purpuratus ( Sp ). 79 of 80 genes (98%) in that dGRN are present in the Lv -scRNA-seq dataset, and expressed in the correct lineages in which the dGRN circuits operate. Surprisingly, however, many heterochronies in timing of first expression of dGRN genes have evolved between the two species. Replotting the two dGRNs with precise attention to time of expression revealed a number of feedback inputs that likely buffer the dGRNs, allowing them to maintain function in the face of accumulating heterochronies. Summary statement The early development of the sea urchin embryo was followed using scRNA-seq plus computational methods to trace lineage diversifications. These were matched to gene regulatory network changes over time.

“Regulative development” demonstrated by many animal embryos, is the ability to replace missing cells or parts. The underlying molecular mechanism(s) of that ability is not well understood. If sea urchin micromeres (skeletogenic cell progenitors) are removed at the 16-cell stage, early endoderm initiates a sequential switch in cell fates, called “transfating”. Without micromeres, other mesoderm cells are absent as well, because their specification depends on signaling from micromeres. Most mesoderm cells later return by transfating, but pigment cells do not. ScRNA-seq, tracked over time, reveals the reprogramming sequence of those replacements. Beginning with an early endoderm specification state, cells progress through endomesoderm, then mesoderm, and finally distinct skeletogenic and blastocoelar cell specification states emerge, but pigment cells do not. Rescue of pigment cells was found to be a consequence of signal timing: if Delta is expressed prior to Nodal, pigment cells return. Thus, transfating operates through a series of gene regulatory state transitions, and reprogramming fails if endogenous negative signals occur prior to positive signals in the reprogramming sequence.

ABSTRACT Biphasic lifecycles are widespread among animals, but little is known about how the developmental transition between larvae and adults is regulated. Sea urchins are a unique system for studying this phenomenon because of the stark differences between their bilateral larval and pentaradial adult body plans. Here, we use single-cell RNA sequencing to analyze the development of Heliocidaris erythrogramma (He), a sea urchin species with an accelerated, non-feeding mode of larval development. The sequencing time course extends from embryogenesis to roughly a day before the onset of metamorphosis in He larvae, which is a period that has not been covered by previous datasets. We find that the non-feeding developmental strategy of He is associated with several changes in the specification of larval cell types compared to sea urchins with feeding larvae, such as the loss of a larva-specific skeletal cell population. Furthermore, the development of the larval and adult body plans in sea urchins may utilize largely different sets of regulatory genes. These findings lay the groundwork for extending existing developmental gene regulatory networks to cover additional stages of biphasic lifecycles.

Altered regulatory interactions during development likely underlie a large fraction of phenotypic diversity within and between species, yet identifying specific evolutionary changes remains challenging. Analysis of single-cell developmental transcriptomes from multiple species provides a powerful framework for unbiased identification of evolutionary changes in developmental mechanisms. Here, we leverage a "natural experiment" in developmental evolution in sea urchins, where a major life history switch recently evolved in the lineage leading to