Abstract Short tandem repeat (STR) instability is causally linked to pathologic transcriptional silencing in a subset of repeat expansion disorders. In fragile X syndrome (FXS), instability of a single CGG STR tract is thought to repress FMR1 via local DNA methylation. Here, we report the acquisition of more than ten Megabase-sized H3K9me3 domains in FXS, including a 5-8 Megabase block around FMR1 . Distal H3K9me3 domains encompass synaptic genes with STR instability, and spatially co-localize in trans concurrently with FMR1 CGG expansion and the dissolution of TADs. CRISPR engineering of mutation-length FMR1 CGG to normal-length preserves heterochromatin, whereas cut-out to pre-mutation-length attenuates a subset of H3K9me3 domains. Overexpression of a pre-mutation-length CGG de-represses both FMR1 and distal heterochromatinized genes, indicating that long-range H3K9me3-mediated silencing is exquisitely sensitive to STR length. Together, our data uncover a genome-wide surveillance mechanism by which STR tracts spatially communicate over vast distances to heterochromatinize the pathologically unstable genome in FXS. One-Sentence Summary Heterochromatinization of distal synaptic genes with repeat instability in fragile X is reversible by overexpression of a pre-mutation length CGG tract.

ABSTRACT Canonically, heterochromatin formation in fission yeast and metazoans involves di/trimethylation of histone H3 at lysine 9 position (me2/me3-K9-H3) by the histone methyltransferase (HMT) Suv39/Clr4, followed by binding of Swi6/HP1 to me2/me3-K9-H3 via its chromodomain. Subsequent self-association of Swi6/HP1 on adjacent nucleosomes leads to folded heterochromatin structure. An alternate model suggests a cooperative interaction between Clr4 and Swi6/HP1 in heterochromatin assembly. HP1 binding to RNA has also been invoked for heterochromatin silencing in metazoans. Recruitment of Swi6/HP1 to centromere has been shown to be dependent on the RNAi pathway in fission yeast. Here we show that Swi6/HP1 exhibits a hierarchy of binding affinity to RNAs, ranging from promiscuous, low-affinity binding to mRNAs, to moderate-affinity binding to the RNAi-generated siRNAs corresponding to the dg-dh repeats present in pericentromeric heterochromatin regions, to high affinity binding to the RNA-DNA hybrids to the cognate dg-dh repeats. Together with sensitivity of Swi6 localization and silencing to RNaseH, our results suggest a dynamic control of localization of Swi6/HP1 towards the dg-dh repeats versus euchromatic regions. This is mediated by its binding to RNA-DNA hybrid at the dg-dh repeats, as an RNAi-dependent and Me2/me3-K9-H3-independent mechanism of recruitment, leading to heterochromatin formation and silencing.

Proximity ligation based techniques, like HiC, involve restriction digestion followed by ligation of formaldehyde cross-linked chromatin. Through analysis of lamina-associated domains (LADs), inactive X-chromosome in mammals and polytene bands in fly, we first established that the DNA in condensed chromatin had lesser accessibility to restriction endonucleases used in HiC as compared to that in decondensed chromatin. The observed bias was independent of known systematic biases, was not appropriately corrected by existing computational methods, and needed an additional optimization step. We then repurposed this bias to identify novel condensed domains outside LADs, which were bordered by insulators and were dynamically associated with the developmentally regulated epigenetic and transcriptional states. Our observations suggested that the corrected one-dimensional read counts of existing HiC datasets can be reliably repurposed to study the gene-regulatory dynamics associated with chromatin condensation and decondensation.

Mammalian genomes exhibit widespread mono-allelic expression of autosomal genes. However, the mechanistic insight that allows specific expression of one allele remains enigmatic. Here, we present evidence that the linear and the three dimensional architectures of the genome ascribe the appropriate framework that guides the mono-allelic expression of genes. We show that: 1) mono-allelically expressed genes are assorted into genomic domains that are insulated from domains of bi-allelically expressed genes through CTCF mediated chromatin loops; 2) evolutionary and cell-type specific gain and loss of mono-allelic expression coincide respectively with the gain and loss of chromatin insulator sites; 3) dosage of mono-allelically expressed genes is more sensitive to loss of chromatin insulationn associated with CTCF depletion as compared to bi-allelically expressed genes; 4) distinct susceptibility of mono- and bi-allelically expressed genes to CTCF depletion can be attributed to distinct functional roles of CTCF around these genes. Altogether, our observations highlight a general topological framework for the mono-allelic expression of genes, wherein the alleles are insulated from the spatial interference of chromatin and transcriptional states from neighbouring bi-allelic domains via CTCF mediated chromatin loops. The study also suggests that the three-dimensional genome organization might have evolved under the constraint to mitigate the fluctuations in the dosage of mono-allelically expressed genes, which otherwise are dosage sensitive.

Conserved noncoding elements (CNEs) have significant regulatory influence on their neighbouring genes. Loss of synteny to CNEs through genomic rearrangements can, therefore, impact the transcriptional states of the cognate genes. Yet, the evolutionary implications of such chromosomal position effects have not been studied. Through genome-wide analysis of CNEs and the cognate genes of representative species from 5 different mammalian orders, we observed significant loss of synteny to CNEs in rat lineage. The CNEs and genes losing synteny had significant association with the fetal, but not the post-natal, brain development as assessed through ontology terms, developmental gene expression, chromatin marks and genetic mutations. The loss of synteny correlated with the independent evolutionary loss of fetus-specific upregulation of genes in rat brain. DNA-breakpoints implicated in brain abnormalities of germ-line origin had significant representation between CNE and the gene that exhibited loss of synteny, signifying the underlying developmental tolerance of genomic rearrangements that had allowed the evolutionary splits of CNEs and the cognate genes in rodent lineage. These observations highlighted the non-trivial impact of chromosomal position-effect in shaping the evolutionary dynamics of mammalian brain development and might explain loss of brain traits, like cerebral folding of cortex, in rodent lineage.

More than 60 human disorders have been linked to unstable expansion of short tandem repeat (STR) tracts. STR length and the extent of DNA methylation is linked to disease pathology and can be mosaic in a cell type-specific manner in several repeat expansion disorders. Mosaic phenomenon have been difficult to study to date due to technical bias intrinsic to repeat sequences and the need for multi-modal measurements at single-allele resolution. Nanopore long-read sequencing accurately measures STR length and DNA methylation in the same single molecule but is cost prohibitive for studies assessing a target locus across multiple experimental conditions or patient samples. Here, we describe MASTR-seq, M ultiplexed A nalysis of S hort T andem R epeats, for cost-effective, high-throughput, accurate, multi-modal measurements of DNA methylation and STR genotype at single-allele resolution. MASTR-seq couples long-read sequencing, Cas9-mediated target enrichment, and PCR-free multiplexed barcoding to achieve a >ten-fold increase in on-target read mapping for 8-12 pooled samples in a single MinION flow cell. We provide a detailed experimental protocol and computational tools and present evidence that MASTR-seq quantifies tract length and DNA methylation status for CGG and CAG STR loci in normal-length and mutation-length human cell lines. The MASTR-seq protocol takes approximately eight days for experiments and one additional day for data processing and analyses.