Abstract Grassland ecosystems form 30-40% 1 of total land cover and provide essential ecosystem services, including food production, flood mitigation and carbon storage 2 . Their productivity is closely related to soil microbial communities 3 , yet the role of viruses within these critical ecosystems is currently undercharacterised 4 and in particular, our knowledge of soil RNA viruses is significantly limited 5 . Here, we applied viromics 6 to characterise soil RNA viral communities along an altitudinal productivity gradient of peat, managed grassland and coastal soils. We identified 3,462 viral operational taxonomic units (vOTUs) and assessed their spatial distribution, phylogenetic diversity and potential host ranges. Soil types exhibited showed minimal similarity in viral community composition, but with >10-fold more vOTUs shared between managed grassland soils when compared with peat or coastal soils. Phylogenetic analyses of viral sequences predicted broad host ranges including bacteria, plants, fungi, vertebrates and invertebrates, contrasting with soil DNA viromes which are typically dominated by bacteriophages 7 . RNA viral communities therefore likely have the ability to influence soil ecosystems across multiple trophic levels. Our study represents an important step towards the characterisation of terrestrial RNA viral communities and the intricate interactions with their hosts, which will provide a more holistic view of the biology of economically and ecologically important terrestrial ecosystems.

ABSTRACT Many fundamental characteristics of soil viruses remain underexplored, including the effects of high temperatures on viruses and their hosts, as would be encountered under disturbances like wildland fire, prescribed burning, and soil solarization. In this study, we leveraged three data types (DNase-treated viromes, non-DNase-treated viromes, and 16S rRNA gene amplicon sequencing) to measure the responses of soil viral and prokaryotic communities to heating to 30°C, 60°C, or 90°C, in comparison to field and control conditions. We investigated (1) the response of dsDNA viral communities to heating of soils from two horizons (O and A) from the same forest soil profile, (2) the extent to which specific viral taxa could be identified as heat-sensitive or heat-tolerant across replicates and soil horizons, and (3) prokaryotic and virus-host dynamics in response to heating. We found that both viral and prokaryotic communities responded similarly to the treatment variables. Community composition differed most significantly by soil source (O or A horizon). Within both soil horizons, viral and prokaryotic communities clustered into three groups, based on beta-diversity patterns: the ambient community (field, control, and 30°C samples) and the 60°C and 90°C communities. As DNase-treated viromic DNA yields were below detection limits at 90°C, we infer that most viral capsids were compromised after the 90°C treatment, indicating a maximum temperature threshold between 60°C and 90°C for most viral particles in these soils. We also identified groups of heat-tolerant and heat-sensitive vOTUs across both soil sources. Overall, we found that over 70% of viral populations, like their prokaryotic counterparts, could withstand temperatures as high as 60°C, with shifts in relative abundance explaining most community compositional differences across heating treatments.

Soil viruses are expected to be pivotal members of soil ecosystems, and recent advances in viral size fraction metagenomic (viromic) approaches have substantially improved our ability to interrogate soil viral ecology. However, the first step of viromics relies on extraction buffers to effectively remove viral particles from the soil matrix for downstream analysis, and viral extraction efficiency at this stage could be affected by the interplay between viral particles, soils, and extraction buffer chemistry. Here, we investigated whether extraction buffer chemistry affected extractable viral community composition measured by viromics from different soil types, for both biological (samples collected 1 meter apart) and technical (subsamples from the same soil homogenate) replicates. We first investigated protein-supplemented phosphate-buffered saline pH (PPBS, pHs 4.5, 5.5, 6.5, and 7.5) on a forest, grassland and wetland soil that exhibited different soil edaphic properties, and then we tested different buffer chemistries (PPBS, Carbonated Buffer, Glycine, and Saline Magnesium) on just the wetland soil. Spatial distance, or where the sample was taken in the field (i.e., biological replicate), was the primary driver of extractable viral community composition across all buffers and soils tested. Differences in viral community composition according to extraction buffer properties were only observed in the grassland technical replicates at PPBS buffer pH 4.5, as well as in both the wetland technical and biological replicates treated with different buffer chemistries, but the effects of buffer chemistry were secondary to spatial distance in all cases where spatial distance was a factor. The lack of buffering capacity in the grassland soil technical replicates likely increased sorption of some viral particles at pH 4.5, but neither protein composition nor isoelectric point (both calculated bioinformatically) explained this phenomenon. Given that most soil viral ecological studies to date include sample collection schemes over distances much farther apart than the 1-meter distances considered here, results suggest that extraction buffer chemistry is likely of much lower importance than ecological considerations, such as spatial distance, in the design of future soil viral ecological investigations.