Stomata are cellular pores on the leaf epidermis that Grass stomata recruit lateral subsidiary cells (SCs), which are key to the unique stomatal morphology and the efficient plant-atmosphere gas exchange in grasses. Subsidiary mother cells (SMCs) strongly polarise before an asymmetric division forms a SC. Yet apart from a proximal polarity module that includes PANGLOSS1 (PAN1) and guides nuclear migration, little is known regarding the developmental processes that form SCs. Using the genetic model grass Brachypodium distachyon , we identified BdPOLAR, which forms a novel, distal polarity domain in SMCs that is reciprocal to the proximal PAN1 domain. Both polarity domains are required for the formative SC division yet exhibit distinct roles in regulating pre-mitotic nuclear migration and SMC division plane orientation, respectively. Nonetheless, the domains are linked as the proximal domain controls polarisation of the distal domain. In summary, we identified two opposing polarity domains that coordinate the SC division, a process crucial for grass stomatal physiology.

Grasses form morphologically derived, four-celled stomata, where two dumbbell-shaped guard cells (GCs) are flanked by two lateral subsidiary cells (SCs). This innovative form enables rapid opening and closing kinetics and efficient plant-atmosphere gas exchange. The mobile bHLH transcription factor MUTE is required for SC formation in grasses. Yet, if and how MUTE also regulates GC development and if MUTE mobility is required for SC recruitment is unclear. Here, we transgenically impaired BdMUTE mobility from GC to SC precursors in the emerging model grass Brachypodium distachyon . Our data indicates that reduced BdMUTE mobility severely affected the spatiotemporal coordination of GC and SC development. Furthermore, while BdMUTE has a cell-autonomous role in GC division orientation, complete dumbbell morphogenesis of GCs required SC recruitment. Finally, leaf-level gas exchange measurements showed that dosage-dependent complementation of the four-celled grass morphology was mirrored in a gradual physiological complementation of stomatal kinetics. Together, our work revealed a dual role of grass MUTE in regulating GC division orientation and SC recruitment, which in turn was required for GC morphogenesis and the rapid kinetics of grass stomata.

The leaf epidermis is the outermost cell layer forming the interface between plants and the atmosphere that must both provide a robust barrier against (a)biotic stressors and facilitate carbon dioxide uptake and leaf transpiration 1 . To achieve these opposing requirements, the plant epidermis developed a wide range of specialized cell types such as stomata and hair cells. While factors forming these individual cell types are known 2–5 , it is poorly understood how their number and size is coordinated. Here, we identified a role for BdPRX76 / BdPOX , a class III peroxidase, in regulating hair cell and stomatal size in the model grass Brachypodium distachyon . In bdpox mutants prickle hair cells were smaller and stomata were longer. Because stomatal density remained unchanged, the negative correlation between stomatal size and density was disrupted in bdpox and resulted in higher stomatal conductance and lower intrinsic water-use efficiency. BdPOX was exclusively expressed in hair cells suggesting that BdPOX cell-autonomously promotes hair cell size and indirectly restricts stomatal length. Cell wall autofluorescence and lignin stainings indicated a role for BdPOX in lignification or crosslinking of related phenolic compounds at the hair cell base. Ectopic expression of BdPOX in the stomatal lineage increased phenolic autofluorescence in guard cell walls and restricted stomatal elongation in bdpox . Together, we highlight a developmental interplay between hair cells and stomata that optimizes epidermal functionality. We propose that cell-type-specific changes disrupt this interplay and lead to compensatory developmental defects in other epidermal cell types.

Grasses form morphologically derived, four-celled stomata, where two dumbbell-shaped guard cells (GCs) are flanked by two lateral subsidiary cells (SCs). This innovative form enables rapid opening and closing kinetics and efficient plant-atmosphere gas exchange. The mobile bHLH transcription factor MUTE is required for SC formation in grasses. Yet, if and how MUTE also regulates GC development and if MUTE mobility is required for SC recruitment is unclear. Here, we transgenically impaired BdMUTE mobility from GC to SC precursors in the emerging model grass Brachypodium distachyon. Our data indicates that reduced BdMUTE mobility severely affected the spatiotemporal coordination of GC and SC development. Furthermore, while BdMUTE has a cell-autonomous role in GC division orientation, complete dumbbell morphogenesis of GCs required SC recruitment. Finally, leaf-level gas exchange measurements showed that dosage-dependent complementation of the four-celled grass morphology was mirrored in a gradual physiological complementation of stomatal kinetics. Together, our work revealed a dual role of grass MUTE in regulating GC division orientation and SC recruitment, which in turn was required for GC morphogenesis and the rapid kinetics of grass stomata.