Cellular exposure to oxidative stress is known to activate several translational control pathways through ribosome ubiquitination. Two such pathways, Redox-control of translation by ubiquitin (RTU) and Ribosome-associated quality control (RQC), modify the ribosome with K63-linked polyubiquitination, but result in two different ribosome fates. RTU responds to peroxide stress exposure by inducing a burst or ribosome polyubiquitination and subsequent pause of translational elongation. Alternatively, RQC leads to ubiquitination of already stalled ribosomes and mediates their clearance through subunit dissociation. Understanding how site-specific ribosome ubiquitination induces translation regulation is difficult due to the simultaneous occurrence of these distinct translational control pathways. Here we develop a targeted proteomics approach to quantify site-specific ubiquitin modification across the ribosome in steady state and stress conditions. We found several sites to be differentially ubiquitinated due to stress, including sites known to be targeted by the RQC. The results indicate that the RTU and RQC target distinct ribosome subpopulations within the cell, and differentially contribute to the cellular stress response in an oxidative stressor-specific manner. These findings significantly contribute to the dissection of the complex coordination of translation in response to stress and shed light on the integration of important quality control pathways during cellular response to stress

The mammalian response to endoplasmic reticulum (ER) stress dynamically affects all layers of gene expression regulation. We quantified transcript and protein abundance along with footprints of ribosomes and non-ribosomal proteins for thousands of genes in cervical cancer cells responding to treatment with tunicamycin or hydrogen peroxide over an eight hour time course. We identify shared and stress-specific significant regulatory events at the transcriptional and post-transcriptional level and at different phases of the experiment. ER stress regulators increase transcription and translation at different times supporting an adaptive response. ER stress also induces translation of genes from serine biosynthesis and one-carbon metabolism indicating a shift in energy production. Discordant regulation of DNA repair genes suggests transcriptional priming in which delayed translation fine-tunes the early change in the transcriptome. Finally, case studies on stress-dependent alternative splicing and protein-mRNA binding demonstrate the ability of this resource to generate hypotheses for new regulatory mechanisms.

The relative importance of regulation at the mRNA versus protein level is subject to ongoing debate. To address this question in a dynamic system, we mapped the proteomics and transcriptomics changes in mammalian cells responding to stress induced by dithiothreitol over 30 hours. Specifically, we estimated the kinetic parameters for synthesis and degradation of RNA and proteins, and deconvoluted response patterns common and unique to each regulatory level using a new statistical tool. Overall, both regulatory levels were equally important, but differed in their impact on molecule concentrations. Both mRNA and protein changes peaked between two and eight hours, but mRNA expression fold changes were much smaller than those of the proteins. Further, mRNA concentrations were regulated in a transient, spike-like pattern and returned to values close to pre-treatment levels by the end of the experiment. In contrast, protein concentrations switched only once and established a new steady state, consistent with the dominant role of protein regulation during misfolding stress. Finally, we generated hypotheses on specific regulatory modes for example groups of genes.