Advances in single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) now allow for routine structure determination of well-behaved biological specimens to high-resolution. Despite advances in the electron microscope, direct electron detectors, and data processing software, the preparation of high-quality grids with thin layers of vitreous ice containing the specimen of interest in random orientations remains a critical bottleneck for many projects. Although numerous efforts have been dedicated to overcoming hurdles frequently encountered during specimen vitrification using traditional blot-and-plunge specimen preparation techniques, the development of blot-free grid preparation devices provide a unique opportunity to carefully tune ice thickness, particle density, and specimen behavior during the vitrification process for improvements in image quality. Here, we describe critical steps of high-quality grid preparation using a SPT Labtech chameleon, evaluation of grid quality/ice thickness using the chameleon software, high-throughput imaging in the electron microscope, and recommend steps for troubleshooting grid preparation when standard parameters fail to yield suitable specimen.

High-quality grid preparation for single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) remains a bottleneck for routinely obtaining high-resolution structures. The issues that arise from traditional grid preparation workflows are particularly exacerbated for oxygen-sensitive proteins, including metalloproteins, whereby oxygen-induced damage and alteration of oxidation states can result in protein inactivation, denaturation, and/or aggregation. Indeed, 99% of the current structures in the EMBD were prepared aerobically and limited successes for anaerobic cryoEM grid preparation exist. Current practices for anaerobic grid preparation involve a vitrification device located in an anoxic chamber, which presents significant challenges including temperature and humidity control, optimization of freezing conditions, costs for purchase and operation, as well as accessibility. Here, we present a streamlined approach that allows for the (an)aerobic vitrification of oxygen-sensitive proteins using an automated aerobic blot-free grid vitrification device - the SPT Labtech chameleon. This robust workflow allows for high-resolution structure determination of dynamic, oxygen-sensitive proteins, of varying complexity and molecular weight.