Abstract Membrane proteins are frequently modulated by specific protein-lipid interactions. The activation of human inward rectifying potassium (hKir) channels by phosphoinositides (PI) has been well characterised. Here, we apply a coarse-grained molecular dynamics free-energy perturbation (CG-FEP) protocol to capture the energetics of binding of PI lipids to hKir channels. By using either a single- or multi-step approach, we establish a consistent value for the binding of PIP 2 to hKir channels, relative to the binding of the bulk phosphatidylcholine phospholipid. Furthermore, by perturbing amino acid side chains on hKir6.2, we show that the neonatal diabetes mutation E179K increases PIP 2 affinity, while the congenital hyperinsulinism mutation K67N results in a reduced affinity. We show good agreement with electrophysiological data where E179K exhibits a reduction in neomycin sensitivity, implying that PIP 2 binds more tightly E179K channels. This illustrates the application of CG-FEP to compare affinities between lipid species, and for annotating amino acid residues.

Abstract Specific interactions of lipids with membrane proteins contribute to protein stability and function. Multiple lipid interactions surrounding a membrane protein are often identified in molecular dynamics (MD) simulations and are, increasingly, resolved in cryo-EM densities. Determining the relative importance of specific interaction sites is aided by determination of lipid binding affinities by experimental or simulation methods. Here, we develop a method for determining protein-lipid binding affinities from equilibrium coarse-grained MD simulations using binding saturation curves, designed to mimic experimental protocols. We apply this method to directly obtain affinities for cholesterol binding to multiple sites on a range of membrane proteins and compare our results with free energies obtained from density-based equilibrium methods and with potential of mean force calculations, getting good agreement with respect to the ranking of affinities for different sites. Thus, our binding saturation method provides a robust, high-throughput alternative for determining the relative consequence of individual sites seen in e.g. cryo-EM derived membrane protein structures surrounded by a plethora of ancillary lipid densities.

The TREK-2 is a mechanosensitive potassium channel in the two-pore (K2P) potassium channel subfamily. Recent studies of the TREK-2 channel with norfluoxetine reveal that norfluoxetine stabilises a conformation with a lower open probability and disrupts channel gating through a selectivity filter. In addition, multiple specific serotonin reuptake inhibitors (SSRIs) have previously been shown to inhibit the TREK channels subfamily. However, the mechanism of lipid-like SSRI inhibition to the TREK-2 channel is currently unclear. Using molecular dynamic simulation, we show that fluoxetine and escitalopram share the same binding pocket on the TREK-2 channel. We show that fluoxetine inhibits the TREK-2 channel using POPC lipid and directly disrupts the channel gating at the selectivity filter, while escitalopram is a traditional pore blocker, which also disrupts the selectivity filter gating but without POPC dependent inhibition. In addition, we show that both fluoxetine and escitalopram prevent a down-to-up transition when the pressure is applied to the system, showing a conserved mechanism of TREK-2 inhibition. Together, our work reveals mechanistic insight into TREK-2 channel inhibition by lipid-like antidepressants, which could further shed light on rational drug design in the future.

Na+/H+ exchangers (NHE) are found in all cells to regulate intracellular pH, sodium levels and cell volume. The NHE isoform 9 (SLC9A9) fine-tunes endosomal pH, and its activity is linked to glioblastoma, epilepsy, autism spectrum and attention-deficit-hyperactivity disorders. Here, we report cryo-EM structures of horse NHE9 and a cysteine-variant at 3.6 and 3.1 Å resolution, respectively. We show how lysine residues, from a previously unresolved TM2-TM3 β-hairpin loop domain, are positioned above the dimerization interface and interact with the endosomal-specific PI-(3,5)P2 lipid, together with residues located on dimer domain helices. Thermal-shift assays, solid-state membrane (SSM) electrophysiology and MD simulations, corroborates that NHE9 can specifically bind PI-(3,5)P2, and that its addition stabilizes the homodimer and enhances NHE9 activity. We have further determined the cryo-EM structure of E. coli NhaA, confirming the expected coordination of cardiolipin at the dimerization interface, solidifying the concept that Na+/H+ exchanger dimerization and transporter activity can be regulated by specific lipids. Taken together, we propose that the activity of NHE9 is regulated by the PI-(3,5)P2 lipid upon reaching endosomes, which we refer to as an lipid-activation-upon-arrival model.

Abstract Members of the TREK family of two-pore domain (K2P) potassium channels are highly sensitive to regulation by membrane lipids, including phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP 2 ). This study used coarse-grained molecular dynamics (CG-MD) and atomistic MD simulations to model the PIP 2 binding site on both the up and down state conformations of TREK-1. We also calculated the free energy of PIP 2 binding relative to other anionic phospholipids in both conformational states using potential of mean force (PMF) and free energy perturbation (FEP) calculations. Our results identify state-dependent binding of PIP 2 to sites involving the proximal C-terminus and we show that PIP 2 promotes a conformational transition from a down state towards an intermediate that resembles the up state. These results are consistent with functional data for PIP 2 regulation and together provide evidence for a structural mechanism of TREK-1 channel activation by phosphoinositides.

Abstract ATP-sensitive potassium (K ATP ) channels couple the intracellular ATP concentration to insulin secretion. K ATP channel activity is inhibited by ATP binding to the Kir6.2 tetramer and activated by phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP 2 ). Here, we use molecular dynamics (MD) simulation, electrophysiology and fluorescence spectroscopy to show that ATP and PIP 2 occupy different binding pockets that share a single amino acid residue, K39. When both ligands are present, K39 shows a greater preference to co-ordinate with PIP 2 than ATP. A neonatal diabetes mutation at K39 (K39R) increases the number of hydrogen bonds formed between K39 and PIP 2 , reducing ATP inhibition. We also find direct effects on nucleotide binding from mutating E179, a residue proposed to interact with PIP 2 . Our work suggests PIP 2 and ATP interact allosterically to regulate K ATP channel activity.