ABSTRACT The Alternative oxidase (AOX) is a protein involved in maintaining the Krebs cycle in instances where the respiratory chain has been inhibited, while allowing for the maintenance of cell growth and necessary metabolic processes for survival. Among eukaryotes, alternative oxidases have disperse distribution and are found in plants, fungi and a few protists, including Naegleria ssp. Naegleria species are free-living unicellular amoeboflagellates, and include the pathogenic species of N. fowleri , the so-called brain eating amoeba. Using a multidisciplinary approach, we aimed to understand the evolution, localization and function of AOX and the role that plays in Naegleria ’s biology. Our analyses suggest that the protein was present in last common ancestor of the genus and structure prediction showed that all functional residues are also present in Naegleria species. Using a combination of cellular and biochemical techniques, we also functionally characterize N. gruberi ’s AOX in its mitochondria and we demonstrate that its inactivation affects its proliferation. Consequently, we discuss the benefits of the presence of this protein in Naegleria species, along with its potential pathogenicity role in N. fowleri . We predict that our findings will spearhead new explorations to understand the cell biology, metabolism and evolution of Naegleria and other free-living relatives.

Abstract Databases are invaluable for the identification of individual metabolites in untargeted metabolomics analyses, providing annotated pure metabolite references that allow for comparisons with experimentally collected mixture samples. Despite the value of an extensive reference database, publicly available databases for NMR-based metabolomics are often incomplete with respect to experimental conditions and derived NMR annotation parameters, such as peak positions. Hence, they are not designed for visualising the reference spectra alongside an experimental sample spectrum of interest, thus limiting the usefulness of the database. As a consequence, researchers have resorted to their own user- or application based database implementations. In this paper we describe the collection, remediation and integration of annotation data from the publicly available HMDB, BRMB and GISMO NMR metabolomics databases to build the CcpNmr Analysis Simulated Metabolomics Database (CASMDB) that contains 1932 unique metabolite entries. This database, in concert with the AnalysisMetabolomics programme, also allows or accurate simulation of spectra at arbitrary field strengths. Together, these tools underpin the visualising of experimental and simulated metabolite references and their usage in 1D 1 H NMR-based metabolomics studies.

The plant hormone auxin regulates almost every aspect of plant development via the TIR1/AFB-auxin-Aux/IAA auxin co-receptor complex. Within this ternary complex, auxin acts as a molecular glue to promote the binding of Aux/IAA transcriptional repressor proteins to SCFTIR1/AFB ubiquitin-ligase complexes, thereby catalysing their ubiquitin-mediated proteolysis. A conspicuous feature of the crystal structure of the complex is a rare cis W-P bond within the Aux/IAA degron motif. To study receptor complex assembly, we have used NMR to determine the solution structure of the amino-terminal half of the Aux/IAA protein AXR3/IAA17, including the degron, both in isolation and in complex with TIR1 and auxin. We show that this region of AXR3 is intrinsically-disordered with only limited elements of structure and yet the critical degron W-P bond occurs with an unusually high (1:1) ratio of cis to trans isomers. We show that assembly of the co-receptor complex involves both auxin-dependent and -independent interaction events in which the disorder of the Aux/IAA is retained. Further, using the synthetic auxin molecule cvxIAA and by analysing specific Aux/IAA conformers, we show that a subset of auxin-dependent binding events occur away from the base of the canonical auxin binding pocket in TIR1. Our results reveal the existence of a fuzzy, topologically-distinct ternary encounter complex and thus that auxin perception is not limited to sequential, independent binding of auxin and then Aux/IAA to TIR1.

We present a new, quick and accessible assay able to determine the membrane permeability and compare the degree of membrane adhesion of any mixture of small molecules.