Numerous compounds have shown efficacy in limiting development of pulmonary fibrosis using animal models, yet few of these compounds have replicated these beneficial effects in clinical trials. Given the challenges associated with performing clinical trials in patients with idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), it is imperative that preclinical data packages be robust in their analyses and interpretations to have the best chance of selecting promising drug candidates to advance to clinical trials. The American Thoracic Society has convened a group of experts in lung fibrosis to discuss and formalize recommendations for preclinical assessment of antifibrotic compounds. The panel considered three major themes (choice of animal, practical considerations of fibrosis modeling, and fibrotic endpoints for evaluation). Recognizing the need for practical considerations, we have taken a pragmatic approach. The consensus view is that use of the murine intratracheal bleomycin model in animals of both genders, using hydroxyproline measurements for collagen accumulation along with histologic assessments, is the best-characterized animal model available for preclinical testing. Testing of antifibrotic compounds in this model is recommended to occur after the acute inflammatory phase has subsided (generally after Day 7). Robust analyses may also include confirmatory studies in human IPF specimens and validation of results in a second system using in vivo or in vitro approaches. The panel also strongly encourages the publication of negative results to inform the lung fibrosis community. These recommendations are for preclinical therapeutic evaluation only and are not intended to dissuade development of emerging technologies to better understand IPF pathogenesis.

Uncontrolled activation of the coagulation cascade contributes to the pathophysiology of several conditions, including acute and chronic lung diseases. Coagulation zymogens are considered to be largely derived from the circulation and locally activated in response to tissue injury and microvascular leak. Here we report that expression of coagulation factor X (FX) is locally increased in human and murine fibrotic lung tissue, with marked immunostaining associated with bronchial and alveolar epithelia. FXa was a potent inducer of the myofibroblast differentiation program in cultured primary human adult lung fibroblasts via TGF-β activation that was mediated by proteinase-activated receptor–1 (PAR1) and integrin αvβ5. PAR1, αvβ5, and α-SMA colocalized to fibrotic foci in lung biopsy specimens from individuals with idiopathic pulmonary fibrosis. Moreover, we demonstrated a causal link between FXa and fibrosis development by showing that a direct FXa inhibitor attenuated bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice. These data support what we believe to be a novel pathogenetic mechanism by which FXa, a central proteinase of the coagulation cascade, is locally expressed and drives the fibrotic response to lung injury. These findings herald a shift in our understanding of the origins of excessive procoagulant activity and place PAR1 central to the cross-talk between local procoagulant signaling and tissue remodeling.

Abstract Myofibroblasts are the key effector cells responsible for excessive extracellular matrix deposition in multiple fibrotic conditions, including idiopathic pulmonary fibrosis (IPF). The PI3K/Akt/mTOR axis has been implicated in fibrosis, with pan-PI3K/mTOR inhibition currently under clinical evaluation in IPF. Here we demonstrate that rapamycin-insensitive mTORC1 signaling via 4E-BP1 is a critical pathway for TGF-β 1 stimulated collagen synthesis in human lung fibroblasts, whereas canonical PI3K/Akt signaling is not required. The importance of mTORC1 signaling was confirmed by CRISPR-Cas9 gene editing in normal and IPF fibroblasts, as well as in lung cancer-associated fibroblasts, dermal fibroblasts and hepatic stellate cells. The inhibitory effect of ATP-competitive mTOR inhibition extended to other matrisome proteins implicated in the development of fibrosis and human disease relevance was demonstrated in live precision-cut IPF lung slices. Our data demonstrate that the mTORC1/4E-BP1 axis represents a critical signaling node during fibrogenesis with potential implications for the development of novel anti-fibrotic strategies.

The COVID-19 pandemic is an ongoing global health threat, yet our understanding of the dynamics of early cellular responses to this disease remains limited

Abstract Glucocorticoids (GCs) are one of the most used anti-inflammatory drugs worldwide. Despite their widespread use, our understanding of their post-transcriptional effects remains poorly understood. The tristetraprolin (TTP) RNA binding protein (RBP) family (ZFP36, ZFP36L1 and ZFP36L2) has been implicated in inflammation regulation via binding to AU-rich elements (ARE) in mRNAs, with TTP being implicated in GC modulation. We hypothesised that ZFP36L1 and ZFP36L2 are part of the GC pathway and tested this hypothesis in bronchial epithelium, which commonly encounters GC in vivo upon inhalation. Our data show that dexamethasone, a commonly used GC, modulated the levels, subcellular localisation and RNA binding of ZFP36L1/L2. Employing Frac-seq (subcellular fractionation and RNA-sequencing), we show that GC modulated distinct subsets of RNAs in a subcellular-dependent manner. In addition to their mostly known transcriptional effects (116 differentially expressed genes, DEGs), GCs modified the binding to monosomes of myriad mRNAs (83 differentially bound genes, DBGs). We also demonstrate that ZFP36L1/L2 modulated gene expression mainly at the total cytoplasmic and polyribosome binding levels. ZFP36L1/L2 down-regulation led to an increase in ARE-containing mRNAs and a pronounced modification of the effects of GC on gene expression. We observed a small overlap of genes modulated by GCs when comparing control and ZFP36L1/L2 knockdown cells, in a subcellular-dependent manner Our data also suggest a novel role for these RBPs and GCs in epithelial biology via regulation of mRNAs encoding proteins important for epithelial cell function including cellular structure. We believe that our data has further implications in how we investigate gene expression. We show the power of employing sub-cellular fractionation when analysing genome-wide effects for known ‘transcriptional modulators’ such as GCs, as well as a tool to demonstrate the extent of the effect of RBPs on gene expression modulation beyond total RNA levels.

Abstract Lymphangioleiomyomatosis (LAM) is a rare disease which causes lung cysts and respiratory failure. TSC2 deficient ‘LAM cells’ with dysregulated mTOR signalling form nodules with fibroblasts causing lung injury. We examined if mTOR dysregulation could induce senescence and impair responses to lung injury. Senescence markers p21 and p16 were increased in LAM lungs and co-localised with alveolar type 2 cells. The SenMayo senescence gene panel was upregulated in LAM alveolar type 2 cells with senescence supressed by mTOR inhibition in patients. LAM cell / fibroblast spheroid cultures induced senescence markers in alveolar type 2 cell organoids, altered their growth and delayed epithelial scratch wound repair. Upstream regulator analysis predicted alveolar type 2 cell IL6 receptor activation. IL6 was produced by LAM cells, induced p16 and p21 in alveolar type 2 cells, inhibited epithelial wound resolution and was overexpressed in LAM patient serum where it was related to lung function. Wound repair in the presence of TSC2 null LAM cell / fibroblast spheroids was enhanced by the IL6 receptor antagonist Tocilizumab. Our findings show TSC2 loss induces senescence and IL6 production which are associated with impaired lung repair. Targeting IL6 signalling in parallel with mTOR inhibition, may reduce lung damage in LAM.

Abstract Children infected with SARS-CoV-2 rarely progress to respiratory failure, but the risk of mortality in infected people over 85 years of age remains high, despite vaccination and improving treatment options. Here, we take a comprehensive, multidisciplinary approach to investigate differences in the cellular landscape and function of paediatric (<11y), adult (30- 50y) and elderly (>70y) nasal epithelial cells experimentally infected with SARS-CoV-2. Our data reveal that nasal epithelial cell subtypes show different tropism to SARS-CoV-2, correlating with age, ACE2 and TMPRSS2 expression. Ciliated cells are a viral replication centre across all age groups, but a distinct goblet inflammatory subtype emerges in infected paediatric cultures, identifiable by high expression of interferon stimulated genes and truncated viral genomes. In contrast, infected elderly cultures show a proportional increase in ITGB6 hi progenitors, which facilitate viral spread and are associated with dysfunctional epithelial repair pathways. Graphical Abstract

Flow cytometry is widely used for cell identification and characterization and involves labelling biological and clinical samples with fluorochrome-conjugated antibodies specific to cell markers. This requires use of expensive exogenous reagents and necessitates complex pre-processing of samples. Additionally, extensive challenges arise in clinical samples consisting of highly plastic and heterogenous cell types observed in diseases such as cancer. As such, it is challenging to apply flow cytometry to point-of-care diagnostic applications. To address this issue, we investigated the combination of diffuse reflectance spectroscopy (DRS), microfluidics and machine learning to offer rapid, low-cost, label-free cell identification for potential deployment at the point of care. To achieve this, we utilized a compact fibre-optic diffuse reflectance spectrometer with multi-depth sensing capability. This system was applied to a proof-of-concept cell identification study where we were able to discriminate triple negative breast cancer cells from healthy fibroblasts using commercially available flow channel slides (Ibidi GmbH, channel dimensions: 5 mm width, 0.4 mm height). However, we observed high interexperimental variability, which was partially attributed to the relatively large fluidic channels. Thus, we investigated in-house fabrication of microfluidics of varying channel widths (0.6-2mm). To this end, we used a Mars ELEGOO 3D printer and commercially available printing materials to batch fabricate optically and mechanically viable microfluidic chips that were both cheap and customizable. Using these in-house microfluidic devices, we demonstrated DRS-based discrimination of cancer cells of different origins, further indicating the potential of this approach for point-of-care cell identification/characterization. Ultimately, we hope this work will lead to the development of cheap, deployable, and accurate point-of-care tools for rapid, label-free cell identification.