The findings that amyotrophic lateral sclerosis (ALS) patients almost universally display pathological mislocalization of the RNA-binding protein TDP-43 and that mutations in its gene cause familial ALS have nominated altered RNA metabolism as a disease mechanism. However, the RNAs regulated by TDP-43 in motor neurons and their connection to neuropathy remain to be identified. Here we report transcripts whose abundances in human motor neurons are sensitive to TDP-43 depletion. Notably, expression of STMN2, which encodes a microtubule regulator, declined after TDP-43 knockdown and TDP-43 mislocalization as well as in patient-specific motor neurons and postmortem patient spinal cord. STMN2 loss upon reduced TDP-43 function was due to altered splicing, which is functionally important, as we show STMN2 is necessary for normal axonal outgrowth and regeneration. Notably, post-translational stabilization of STMN2 rescued neurite outgrowth and axon regeneration deficits induced by TDP-43 depletion. We propose that restoring STMN2 expression warrants examination as a therapeutic strategy for ALS.

Summary CNS neurons do not regenerate after injury, leading to permanent functional deficits. Although sensory and motor neuron axons do regrow after peripheral nerve injury, functional outcome is limited due to the incomplete and slow regrowth. The lack of human-relevant assays suitable for large-scale drug screens has limited neuro-repair therapy discovery. To address this we developed a phenotypic screening strategy using human induced pluripotent stem cell-derived motor neurons to identify axon-regeneration promoting compounds and targets. The screens involve both re-plating human motor neurons on chondroitin sulfate proteoglycans and measuring regeneration responses to laser axotomy in spot cultures, and from them we identified multiple hits that promote injured axon regrowth. The top hit blebbistatin, a non-muscle myosin II inhibitor, accelerated axon regeneration and functional recovery after sciatic nerve injury in vivo . Human “injury in a dish” assays are suitable, therefore, to screen for therapeutic interventions that can induce or accelerate axon regeneration.

While voltage-gated potassium channels have critical roles in controlling neuronal excitability, they also have non-ion-conducting functions. Kv8.1, encoded by the KCNV1 gene, is a 'silent' ion channel subunit whose biological role is complex since Kv8.1 subunits do not form functional homotetramers but assemble with Kv2 to modify its ion channel properties. We profiled changes in ion channel expression in amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons carrying a superoxide dismutase 1(A4V) mutation to identify what drives their hyperexcitability. A major change identified was a substantial reduction of KCNV1/Kv8.1 expression, which was also observed in patient-derived neurons with C9orf72 expansion. We then studied the effect of reducing KCNV1/Kv8.1 expression in healthy motor neurons and found it did not change neuronal firing but increased vulnerability to cell death. A transcriptomic analysis revealed dysregulated metabolism and lipid/protein transport pathways in KCNV1/Kv8.1-deficient motor neurons. The increased neuronal vulnerability produced by the loss of KCNV1/Kv8.1 was rescued by knocking down Kv2.2, suggesting a potential Kv2.2-dependent downstream mechanism in cell death. Our study reveals, therefore, unsuspected and distinct roles of Kv8.1 and Kv2.2 in amyotrophic lateral sclerosis-related neurodegeneration.

SUMMARY Loss of function of a cell cycle-associated gene NEK1 causes amyotrophic lateral sclerosis (ALS), but how this leads to motor neuron degeneration is unknown. We studied the function of NEK1 in human stem cell-derived motor neurons and found that loss of NEK1 causes decreased neurite length accompanied by transcriptional alterations. We also found that NEK1 interacts with and modulates the formation of the retromer, and that impaired retromer function contributes to neurite outgrowth deficits. We identified SMC3, which interacts with NEK1 during the cell cycle, as a kinase substrate of NEK1 in motor neurons. Notably, loss of SMC3 not only recapitulates the decreased neurite outgrowth, but also affects retromer formation. We suggest that NEK1 interacts with multiple proteins in postmitotic neurons to coordinate retromer formation, and that loss of this leads to impaired neurite outgrowth.

Abstract The Kv8.1 potassium ion channel encoded by the KCNV1 gene is a “silent” subunit whose biological function is unknown. In ALS patient-derived motor neurons carrying SOD1(A4V) and C9orf72 mutations, its expression is highly reduced, yielding increased vulnerability to cell death without a change in motor neuronal firing. Our data suggests that Kv8.1 modulates Kv2 channel function to impact neuronal metabolism and lipid/protein transport pathways, but not excitability.