p62 has been proposed to mark ubiquitinated protein bodies for autophagic degradation. We report that the Drosophila melanogaster p62 orthologue, Ref(2)P, is a regulator of protein aggregation in the adult brain. We demonstrate that Ref(2)P localizes to age-induced protein aggregates as well as to aggregates caused by reduced autophagic or proteasomal activity. A similar localization to protein aggregates is also observed in D. melanogaster models of human neurodegenerative diseases. Although atg8a autophagy mutant flies show accumulation of ubiquitin- and Ref(2)P-positive protein aggregates, this is abrogated in atg8a/ref(2)P double mutants. Both the multimerization and ubiquitin binding domains of Ref(2)P are required for aggregate formation in vivo. Our findings reveal a major role for Ref(2)P in the formation of ubiquitin-positive protein aggregates both under physiological conditions and when normal protein turnover is inhibited.

Abstract Age-dependent loss of cardiac tissue homeostasis largely impacts heart performance and contributes significantly to cardiovascular diseases later in life. Cellular quality control machinery, such as autophagy/lysosome system, plays a crucial role in maintaining cardiac health and preventing age-induced cardiomyopathy and heart failure. However, how aging alters the autophagy/lysosome system to impact cardiac function remains largely unknown. Here using Drosophila heart as a model system, we show that activin signaling, a member of TGF-beta superfamily, negatively regulates cardiac autophagy and cardiac health during aging. We found that cardiac-specific knockdown of Daw , an activin-like protein in Drosophila , increased cardiac autophagy and prevented age-related cardiac dysfunction, including arrhythmia and bradycardia (slow heart rate). Inhibition of autophagy blocked Daw knockdown-mediated cardioprotection. Consistently, cardiac-specific expression of constitutively activated activin type I receptor Babo disrupted cardiac function at young ages. Intriguingly, the key autophagy regulator, mechanistic target of rapamycin complex 1 (mTORC1), was not involved in activin-mediated autophagy. Instead, activin signaling genetically interacted with Rictor, the key subunit of mTORC2, to regulate autophagy and cardiac aging. Knockdown of Daw increased the mRNA expression of Rictor and the phosphorylation of AKT in fly hearts. Finally, cardiac-specific silencing of Daw not only improved cardiac health, but also prolonged lifespan. Thus, our findings highlight an emerging role of activin signaling and mTORC2 in the regulation of autophagy and cardiac aging.

The role of acidic polymers in neutralising bacteriophages is investigated.

Abstract Background MDR organisms pose a major healthcare challenge. The current limitations on antibiotic discovery have necessitated the search for novel discovery methods and sources as well as non-antibiotic alternatives. The basidiomycete-derived, secondary metabolite pleurotin and its congeners could be a proponent of the former, as these have been shown to be effective against Gram-positive bacteria, while bacteriophages (phages) could be the ultimate non-antibiotic alternative. A very promising application of bacteriophage therapy is phage–antibiotic combination (PAC) therapy, where (cocktails of) phage and conventional antibiotic are employed against problematic bacterial strains. In this project, the combination of pleurotin and bacteriophages targeting Staphylococcus aureus was examined. Methods Pleurotin was isolated from the basidiomycete Hohenbuehelia atrocaerulea grown in YM broth. Purification and structure characterization was performed using flash chromatography, LC-MS, HPLC and NMR spectroscopy. Purified pleurotin was compared with pleuromutilin and vancomycin, in combination with phage K against S. aureus (NCTC 9318) in single agent and PAC time–kill assays. The cytotoxicity of pleurotin was assessed using LDH and live/dead viability assays in human diabetic skin fibroblasts in comparison to pleuromutilin, vancomycin and phage K. Results Pleurotin, pleuromutilin and vancomycin both showed expected inhibitory activity against NCTC 9318. Reduced growth was seen in most concentrations. Phage K in combination with both pleurotin and vancomycin showed a decrease in growth rates compared with treatment with phage or antibiotic alone whereas adding phage to pleuromutilin yielded an antagonistic effect. Cytotoxicity of pleurotin in human cells was not significantly different to vancomycin and pleuromutilin. Conclusions Results suggest that phage K can lower the working MIC for pleurotin and vancomycin. Subsequent work revealing efficiency against clinically relevant strains and biofilms will be necessary.

The internal capsid proteins that reside within phage of the Podoviridae family hold high potential for being used as sensitive and reliable diagnostic tools. The concealed nature of the capsid interior ensures that any encapsulated signal or signal generating enzyme, e.g., fused to an internal capsid protein, is suppressed whilst the phage is unaccompanied by its host. Furthermore, the only naturally occurring mechanism for releasing the internal capsid proteins, and therefore exposing their amalgamated signal/enzyme, is for them to be passed through the tail and subsequently ejected out of the phage, a post-adsorption phenomenon which occurs when the host is present, thus presenting a precise model for signal/enzyme release only upon pathogen presence. Here, a small N terminal subunit of the NanoLuc luciferase is fused and incorporated into the K1F internal capsid structure using a simple, non-genomic method. This internalised subunit is exposed to the test solution containing its C terminal counterpart (natural complementation immediately forms the full NanoLuc enzyme) and substrate furimazine in an inducible manner which mimics the presence of the K1F host, E. coli K1 thereby presenting a novel method for rapidly detecting this disease causing pathogen. Finally, it is expected that by building upon this internal capsid protein engineering approach, which completely bypasses the time-inducing processes of intracellular nucleic acid transcription and translation, an unprecedentedly rapid detection device can be developed for an array of bacterial pathogens.

With the recent rise in interest in using lytic bacteriophages as therapeutic agents, there is an urgent requirement to understand their fundamental biology to enable the engineering of their genomes. Current methods of phage engineering rely on homologous recombination, followed by a system of selection to identify recombinant phages. For bacteriophage T7, the host genes cmk or trx have been used as a selection mechanism along with both type I and II CRISPR systems to select against wild-type phage and enrich for the desired mutant. Here we systematically compare all three systems; we show that the use of marker-based selection is the most efficient method and we use this to generate multiple T7 tail fiber mutants. Furthermore, we found the type II CRISPR-Cas system is easier to use and generally more efficient than a type I system in the engineering of phage T7. These results provide a foundation for the future, more efficient engineering of bacteriophage T7.