Yellow mutants of the green fluorescent protein (YFP) are crucial constituents of genetically encoded indicators of signal transduction and fusions to monitor protein-protein interactions. However, previous YFPs show excessive pH sensitivity, chloride interference, poor photostability, or poor expression at 37 °C. Protein evolution in Escherichia coli has produced a new YFP named Citrine, in which the mutation Q69M confers a much lower pK a (5.7) than for previous YFPs, indifference to chloride, twice the photostability of previous YFPs, and much better expression at 37 °C and in organelles. The halide resistance is explained by a 2.2-Å x-ray crystal structure of Citrine, showing that the methionine side chain fills what was once a large halide-binding cavity adjacent to the chromophore. Insertion of calmodulin within Citrine or fusion of cyan fluorescent protein, calmodulin, a calmodulin-binding peptide and Citrine has generated improved calcium indicators. These chimeras can be targeted to multiple cellular locations and have permitted the first single-cell imaging of free [Ca2+] in the Golgi. Citrine is superior to all previous YFPs except when pH or halide sensitivity is desired and is particularly advantageous within genetically encoded fluorescent indicators of physiological signals. Yellow mutants of the green fluorescent protein (YFP) are crucial constituents of genetically encoded indicators of signal transduction and fusions to monitor protein-protein interactions. However, previous YFPs show excessive pH sensitivity, chloride interference, poor photostability, or poor expression at 37 °C. Protein evolution in Escherichia coli has produced a new YFP named Citrine, in which the mutation Q69M confers a much lower pK a (5.7) than for previous YFPs, indifference to chloride, twice the photostability of previous YFPs, and much better expression at 37 °C and in organelles. The halide resistance is explained by a 2.2-Å x-ray crystal structure of Citrine, showing that the methionine side chain fills what was once a large halide-binding cavity adjacent to the chromophore. Insertion of calmodulin within Citrine or fusion of cyan fluorescent protein, calmodulin, a calmodulin-binding peptide and Citrine has generated improved calcium indicators. These chimeras can be targeted to multiple cellular locations and have permitted the first single-cell imaging of free [Ca2+] in the Golgi. Citrine is superior to all previous YFPs except when pH or halide sensitivity is desired and is particularly advantageous within genetically encoded fluorescent indicators of physiological signals. yellow-emission variants of GFP green fluorescent protein cyan fluorescent protein GFP with mutations S65G/V68L/Q69K/S72A/T203Y GFP with mutations S65G/V68L/Q69M/S72A/T203Y fluorescence resonance energy transfer a protein construct consisting of CFP, calmodulin, M13, and YFP fused in sequence a YFP with calmodulin inserted at position 145 endoplasmic reticulum polymerase chain reaction 4-morpholinepropanesulfonic acid galactosyltransferase Yellow fluorescent proteins (YFPs)1 were created (1Ormö M. Cubitt A.B. Kallio K. Gross L.A. Tsien R.Y. Remington S.J. Science. 1996; 273: 1392-1395Crossref PubMed Scopus (1977) Google Scholar) by mutating Thr203 of the Aequorea victoria green fluorescent protein (GFP) (2Tsien R.Y. Annu. Rev. Biochem. 1998; 67: 509-544Crossref PubMed Scopus (5064) Google Scholar) to aromatic amino acids, typically Tyr. The resulting π-π stacking and increased local polarizability immediately adjacent to the chromophore are believed to be responsible for the ∼20-nm shift to longer excitation and emission wavelengths (3Wachter R.M. Elsliger M.-A. Kallio K. Hanson G.T. Remington S.J. Structure. 1998; 6: 1267-1277Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (371) Google Scholar). However, the changes in internal hydrogen bonding and steric packing also made the fluorescence more vulnerable to photobleaching (4Dickson R.M. Cubitt A.B. Tsien R.Y. Moerner W.E. Nature. 1997; 388: 355-358Crossref PubMed Scopus (1185) Google Scholar, 5Miyawaki A. Tsien R.Y. Methods Enzymol. 2000; 327: 472-500Crossref PubMed Scopus (387) Google Scholar), decolorization by protonation (6Llopis J. McCaffery J.M. Miyawaki A. Farquhar M.G. Tsien R.Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 6803-6808Crossref PubMed Scopus (947) Google Scholar, 7Matsuyama S. Llopis J. Deveraux Q.L. Tsien R.Y. Reed J.C. Nat. Cell Biol. 2000; 2: 318-325Crossref PubMed Scopus (642) Google Scholar, 8Miyawaki A. Griesbeck O. Heim R. Tsien R.Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 2135-2140Crossref PubMed Scopus (737) Google Scholar, 9Elsliger M.-A. Wachter R.M. Hanson G.T. Kallio K. Remington S.J. Biochemistry. 1999; 38: 5296-5301Crossref PubMed Scopus (295) Google Scholar, 10Wachter R.M. Yarbrough D. Kallio K. Remington S.J. J. Mol. Biol. 2000; 301: 157-171Crossref PubMed Scopus (136) Google Scholar), and quenching by many anions (10Wachter R.M. Yarbrough D. Kallio K. Remington S.J. J. Mol. Biol. 2000; 301: 157-171Crossref PubMed Scopus (136) Google Scholar, 11Wachter R.M. Remington S.J. Curr. Biol. 1999; 9: R628-R629Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (143) Google Scholar, 12Jayaraman S. Haggie P. Wachter R.M. Remington S.J. Verkman A.S. J. Biol. Chem. 2000; 275: 6047-6050Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (261) Google Scholar), of which chloride is the physiologically most relevant. These sensitivities can be exploited for specialized applications such as measuring fluorescence recovery after photobleaching and sensing pH and halide concentrations, but are deleterious for using YFPs either as simple fusion tags or as acceptors for fluorescence resonance energy transfer (FRET). YFPs are becoming very popular in such roles, particularly as partners for cyan fluorescent protein (CFP) mutants of GFP (2Tsien R.Y. Annu. Rev. Biochem. 1998; 67: 509-544Crossref PubMed Scopus (5064) Google Scholar, 5Miyawaki A. Tsien R.Y. Methods Enzymol. 2000; 327: 472-500Crossref PubMed Scopus (387) Google Scholar, 13Tsien R.Y. Miyawaki A. Science. 1998; 280: 1954-1955Crossref PubMed Scopus (160) Google Scholar, 14Ellenberg J. Lippincott-Schwartz J. Presley J.F. Trends Cell Biol. 1999; 9: 52-56Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (119) Google Scholar, 15Green G. Kain S.R. Angres B. Methods Enzymol. 2000; 327: 89-94Crossref PubMed Scopus (3) Google Scholar). CFPs and YFPs are spectroscopically well enough separated to be easily distinguishable in either excitation or emission spectra, yet the emission wavelengths of CFPs and excitation wavelengths of YFPs overlap well enough to make them good partners for FRET. They have largely superseded the initial pairing of blue mutants and improved green forms of GFP (16Heim R. Tsien R.Y. Curr. Biol. 1996; 6: 178-182Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1226) Google Scholar), because the blue mutants were too dim and photobleachable, and because shorter wavelengths generically excite more autofluorescence and raise more concerns of phototoxicity. Measurements of FRET between CFP and YFP are becoming increasingly common to monitor protein-protein interactions nondestructively in live cells (5Miyawaki A. Tsien R.Y. Methods Enzymol. 2000; 327: 472-500Crossref PubMed Scopus (387) Google Scholar, 13Tsien R.Y. Miyawaki A. Science. 1998; 280: 1954-1955Crossref PubMed Scopus (160) Google Scholar, 17Zacharias D.A. Baird G.S. Tsien R.Y. Curr. Opin. Neurobiol. 2000; 10: 416-421Crossref PubMed Scopus (91) Google Scholar). The potential partners are fused to CFP and YFP, respectively, and coexpressed in cells. Because FRET requires that the CFP and YFP be within a few nanameters of each other, it can detect proximity at molecular dimensions, with 2 orders of magnitude higher spatial resolution than simple co-localization of the two colors. This approach has been used to monitor interactions of nuclear receptors and coactivators (18Llopis J. Westin S. Ricote M. Wang J. Cho C.Y. Kurokawa R. Rose D.W. Rosenfeld M.G. Tsien R.Y. Glass C.K. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 4363-4368Crossref PubMed Scopus (131) Google Scholar), nuclear transport factors (19Damelin M. Silver P.A. Mol. Cell. 2000; 5: 133-140Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (124) Google Scholar), protein kinase A and anchoring proteins (20Ruehr M.L. Zakhary D.R. Damron D.S. Bond M. J. Biol. Chem. 1999; 274: 33092-33096Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (25) Google Scholar), G-protein subunits (21Janetopoulos C. Jin T. Devreotes P. Science. 2001; 291: 2408-2411Crossref PubMed Scopus (389) Google Scholar), G-protein-coupled receptors (22Overton M.C. Blumer K.J. Curr. Biol. 2000; 10: 341-344Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (269) Google Scholar), and cytokine receptors (23Siegel R.M. Frederiksen J.K. Zacharias D.A. Chan F.K.M. Johnson M. Lynch D. Tsien R.Y. Lenardo M.J. Science. 2000; 288: 2354-2357Crossref PubMed Scopus (547) Google Scholar). FRET can also detect intramolecular conformational changes, particularly within genetically encoded fluorescent indicators for a wide variety of intracellular analytes and processes such as Ca2+ (8Miyawaki A. Griesbeck O. Heim R. Tsien R.Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 2135-2140Crossref PubMed Scopus (737) Google Scholar, 24Romoser V.A. Hinkle P.M. Persechini A. J. Biol. Chem. 1997; 272: 13270-13274Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (351) Google Scholar, 25Persechini A. Lynch J.A. Romoser V.A. Cell Calcium. 1997; 22: 209-216Crossref PubMed Scopus (102) Google Scholar, 26Miyawaki A. Llopis J. Heim R. McCaffery J.M. Adams J.A. Ikura M. Tsien R.Y. Nature. 1997; 388: 882-887Crossref PubMed Scopus (2688) Google Scholar), (Ca2+)4-CaM (27Persechini A. Cronk B. J. Biol. Chem. 1999; 274: 6827-6830Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (137) Google Scholar), Zn2+ (5Miyawaki A. Tsien R.Y. Methods Enzymol. 2000; 327: 472-500Crossref PubMed Scopus (387) Google Scholar), NO (28Pearce L.L. Gandley R.E. Han W. Wasserloos K. Stitt M. Kanai A.J. McLaughlin M.K. Pitt B.R. Levitan E.S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 477-482Crossref PubMed Scopus (216) Google Scholar), cGMP (29Sato M. Hida N. Ozawa T. Umezawa Y. Anal. Chem. 2000; 72: 5918-5924Crossref PubMed Scopus (114) Google Scholar, 30Honda A. Adams S.R. Sawyer C.L. Lev-Ram V. Tsien R.Y. Dostmann W.R.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 2437-2442Crossref PubMed Scopus (230) Google Scholar), protease activation (31Mahajan N.P. Harrison-Shostak D.C. Michaux J. Herman B. Chem. Biol. 1999; 6: 401-409Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (112) Google Scholar, 32Vanderklish P.W. Krushel L.A. Holst B.H. Gaily J.A. Crossin K.L. Edelman G.M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 2253-2258Crossref PubMed Scopus (149) Google Scholar), and protein kinase A-dependent phosphorylation (33Nagai Y. Miyazaki M. Aoki R. Zama T. Inouye S. Hirose K. Iino M. Hagiwara M. Nat. Biotechnol. 2000; 18: 313-316Crossref PubMed Scopus (178) Google Scholar). Genetically encoded indicators offer the major advantages of versatile and modular construction, applicability to intact transgenic organisms, and precise targetability to specific tissues, organelles, and subcellular microenvironments. These advantages are particularly important for Ca2+ indicators, which have been the subject of more effort than any of the other indicator classes. Both ratiometric and non-ratiometric indicators of Ca2+ have been constructed from CFP, GFP, or YFP (2Tsien R.Y. Annu. Rev. Biochem. 1998; 67: 509-544Crossref PubMed Scopus (5064) Google Scholar) as fluorophores and calmodulin as calcium binding moiety in several configurations. In cameleons (26Miyawaki A. Llopis J. Heim R. McCaffery J.M. Adams J.A. Ikura M. Tsien R.Y. Nature. 1997; 388: 882-887Crossref PubMed Scopus (2688) Google Scholar), an N-terminal CFP is fused to calmodulin, the calmodulin-binding peptide M13 from myosin light chain kinase, and a C-terminal YFP. Binding of Ca2+ to calmodulin leads to a conformational change that enhances the fluorescence resonance energy transfer (FRET) from the shorter wavelength emitting CFP to the longer wavelength emitting YFP. Subsequent modifications in the YFP acceptor protein led to improved cameleons with decreased sensitivity to cytosolic pH changes (8Miyawaki A. Griesbeck O. Heim R. Tsien R.Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 2135-2140Crossref PubMed Scopus (737) Google Scholar). The YFP portion of these improved cameleons (termed EYFP V68L/Q69K) had a pK a of 6.1, rendering it largely insensitive to pH changes near neutrality. However, due to poor folding at 37 °C, specific targeting was hard to achieve. In a different approach, calmodulin was directly inserted into the backbone of YFP in place of Tyr145 to generate a medium affinity Ca2+ indicator termed camgaroo-1 that increased fluorescence intensity ∼8-fold upon saturation with Ca2+(34Baird G.S. Zacharias D.A. Tsien R.Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 11241-11246Crossref PubMed Scopus (770) Google Scholar). A problem with this non-ratiometric indicator was that the fluorescence of the indicator in transfected cells at resting Ca2+ levels was almost zero, making it difficult to identify transfected cells for experiments. Also, the protein did not express well at 37 °C. In an effort to overcome these problems, we undertook an expression screen in Escherichia coli and identified an improved mutant of YFP, consisting of GFP with mutations S65G/V68L/Q69M/S72A/T203Y. For brevity we have named this mutation Citrine to reflect its yellow color and acid resistance. Citrine folds well at 37 °C, can be targeted to subcellular compartments, and has a pK a of 5.7. Some aspects of the photophysics of Citrine, including two-photon spectra, light-driven flickering, excitation state decay kinetics, and translational and rotational diffusion were recently described (35Heikal A.A. Hess S.T. Baird G.S. Tsien R.Y. Webb W.W. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 11996-12001Crossref PubMed Scopus (300) Google Scholar), but these measurements were wholly in vitro, did not document the superiority of Citrine over previous YFPs, and did not explain why the Q69M mutation conferred beneficial properties. Using Citrine, we have now constructed new genetic indicators of cellular Ca2+ dynamics and assessed their properties with respect to pH interference, folding, and targeting in mammalian cells. In addition, we have determined the 2.2-Å x-ray structure of Citrine and propose a structural explanation for the various improvements conferred upon Citrine by the Q69M mutation. cDNA encoding camgaroo-1 (34Baird G.S. Zacharias D.A. Tsien R.Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 11241-11246Crossref PubMed Scopus (770) Google Scholar) in the vector pRSETB (Invitrogen) was subjected to error-prone PCR using Taq polymerase. The 5′ primer included a BamHI site and ended at the starting Met of the GFP, and the 3′ primer included an EcoRI site and ended at the stop codon, theoretically allowing mutagenesis of every base of camgaroo-1 other than Met1. The PCR (38 cycles with annealing at 55 °C) was run in four 100-µl batches, each containing 10 µl of 10 × PCR buffer with Mg2+ (Roche Molecular Biochemicals), 150 µm Mn2+, 250 µm of three nucleotides, 50 µm of the remaining nucleotide, and 5 ng of template. Mutagenic PCR products were combined, purified by agarose gel electrophoresis, digested withBamHI and EcoRI, and repurified by QiaQuick columns (Qiagen). The resulting fragment was ligated into pRSETB, and the crude ligation mixture was transformed intoE. coli BL21(DE3) Gold (Stratagene) by electroporation. Bacteria plated on LB/agar plates were imaged as described (34Baird G.S. Zacharias D.A. Tsien R.Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 11241-11246Crossref PubMed Scopus (770) Google Scholar), and colonies that became fluorescent after overnight incubation at 37 °C were grown in liquid culture and the plasmid DNA obtained by Miniprep (Qiagen). Protein was expressed and purified as previously described (34Baird G.S. Zacharias D.A. Tsien R.Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 11241-11246Crossref PubMed Scopus (770) Google Scholar). Spectroscopy of purified protein was typically performed in 100 mm KCl, 10 mm MOPS, pH 7.25, in a fluorescence spectrometer (Fluorolog-2, Spex Industries). pH titrations were performed as described (34Baird G.S. Zacharias D.A. Tsien R.Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 11241-11246Crossref PubMed Scopus (770) Google Scholar). All DNA sequencing was performed by the Molecular Pathology Shared Resource, University of California, San Diego, Cancer Center. Mutations Q69M (Citrine), C48L, and C70V were introduced into EYFP V68L/Q69K by site-directed mutagenesis (QuikChange, Stratagene). To generate yellow cameleon-2.3 (YC2.3) and YC3.3, Citrine was inserted into the previously described cameleons YC2 and YC3 (26Miyawaki A. Llopis J. Heim R. McCaffery J.M. Adams J.A. Ikura M. Tsien R.Y. Nature. 1997; 388: 882-887Crossref PubMed Scopus (2688) Google Scholar) in the cloning vector pUC119, and then subcloned into the mammalian expression vector pcDNA3 (Invitrogen). Targeting to the endoplasmic reticulum (ER) was achieved by the calreticulin signal peptide and the KDEL ER-retention sequence (36Kendall J.M. Dormer R.L. Campbell A.K. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1992; 189: 1008-1016Crossref PubMed Scopus (90) Google Scholar). Targeting to the medial/trans-Golgi was achieved using the type II membrane-anchored protein galactosyltransferase (GT), which has been used to target GFP to this organelle (6Llopis J. McCaffery J.M. Miyawaki A. Farquhar M.G. Tsien R.Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 6803-6808Crossref PubMed Scopus (947) Google Scholar). Mitochondrial targeting of camgaroo-2 was achieved by replacing ECFP with the camgaroo-2 coding sequence in the pECFP-Mito vector (CLONTECH), which uses the targeting sequence of subunit VIII of cytochrome c oxidase. In order to evaluate targeted expression of YFP mutants, identical amounts of DNA (20 µg) of EYFP V68L/Q69K-ER, Citrine-ER, or Citrine C48L/C70V-ER in pcDNA3 were transfected into HeLa cells (3 × 105 per 35-mm dish) with Lipofectin (Life Technologies, Inc.). After 2 days of expression cells were suspended in Hanks' balanced saline solution, normalized atA 600, and measured in the fluorescence spectrometer. Single HeLa cells were imaged with a charge-coupled device camera (Photometrics, Tucson, AZ) as described (26Miyawaki A. Llopis J. Heim R. McCaffery J.M. Adams J.A. Ikura M. Tsien R.Y. Nature. 1997; 388: 882-887Crossref PubMed Scopus (2688) Google Scholar) at room temperature 1–5 days after transfection. The excitation filter for ratiometric imaging was 440DF10 with a 455DCLP dichroic mirror. The emission filters were 480DF30 (CFP) or 535DF25 (Citrine). Experiments were processed digitally using Metafluor software version 2.75 or 4.01 (Universal Imaging, West Chester, PA). For imaging camgaroo-2, a 480DF30 excitation filter was used in combination with a fluorescein dichroic mirror and emission filter 535DF25. Citrine in vector pRSETB was expressed in E. coli JM109(DE3) and the protein purified as previously described (34Baird G.S. Zacharias D.A. Tsien R.Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 11241-11246Crossref PubMed Scopus (770) Google Scholar). Following enterokinase (Invitrogen) catalyzed proteolysis of the 6-His tag, 1 ml of Ni-NTA-agarose (Qiagen) was added to bind residual uncleaved protein and 6-His peptides and the solution was gently agitated (4 °C for 2 h). Agarose resin was removed by filtration and the protein was concentrated to 20 mg/ml with a Micron-30 (Amicon). Citrine was crystallized by hanging drop vapor diffusion at 4 °C by addition of equal volumes of protein and crystallization buffer (7% PEG 3400, 50 mm NH4OAc, 50 mm NaOAc, pH 5.0). Crystals were visible after 3–4 days and grew to ∼0.5 × 0.2 × 0.2 mm within 14 days. The crystals belong to space group P212121 with unit cell dimensions of a = 52.50 Å,b = 61.76 Å, and c = 70.68 Å and one monomer per asymmetric unit. X-ray intensity data on a single crystal were collected at room temperature on a Mar 345 image plate detector (Mar Research) with a multilayer mirror monochromated CuKα beam from a Rigaku FR rotating anode x-ray generator with mirrors. The crystal diffracted to 2.2-Å resolution with an R mergeof 5.5 and 99.3% completeness with 4.8-fold redundancy. All data were integrated and scaled with DENZO/SCALEPACK (37Otwinowski Z. Minor W. Methods Enzymol. 1997; 276: 307-326Crossref PubMed Scopus (38799) Google Scholar). The WilsonB factor is 29.7 Å2. The atomic coordinates of the Protein Data Bank (PDB) entry 2YFP (3Wachter R.M. Elsliger M.-A. Kallio K. Hanson G.T. Remington S.J. Structure. 1998; 6: 1267-1277Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (371) Google Scholar) with all solvent molecules, the chromophore, and residue Gln 69 removed were used as the starting model for refinement. The B factor for all atoms was set to 25 Å2. One round of rigid body refinement, simulated annealing, and individual B factor refinement in CNS (38Brunger A.T. Adams P.D. Clore G.M. DeLano W.L. Gros P. Grosse-Kunstleve R.W. Jiang J.S. Kuszewski J. Nilges M. Pannu N.S. Read R.J. Rice L.M. Simonson T. Warren G.L. Acta Cryst. D Biol. Cryst. 1998; 54: 905-921Crossref PubMed Scopus (17027) Google Scholar) resulted in an R factor = 24% and anR free = 29%. Refinement proceeded with alternate rounds of manual adjustment in XTALVIEW (39McRee D.E. J. Struct. Biol. 1999; 125: 156-165Crossref PubMed Scopus (2023) Google Scholar) and simulated annealing/B factor refinement in CNS. The stereochemistry of the model was evaluated with PROCHECK (40Laskowski R.A. MacArthur M.W. Moss D.S. Thornton J.M. J. Appl. Cryst. 1993; 26: 283-291Crossref Google Scholar). The most favored regions of the Ramachandran plot contained 89.6% of the nonglycine residues with the remaining 10.4% in the additional allowed regions. Cavity volumes were determined with MSMS (41Sanner M.F. Olson A.J. Spehner J.C. Biopolymers. 1996; 38: 305-320Crossref PubMed Google Scholar). Our newest and best YFP arose from efforts to improve camgaroo-1 (34Baird G.S. Zacharias D.A. Tsien R.Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 11241-11246Crossref PubMed Scopus (770) Google Scholar), a genetically encoded Ca2+ indicator consisting ofXenopus calmodulin inserted in place of residue 145 of EYFP-Q69K (2Tsien R.Y. Annu. Rev. Biochem. 1998; 67: 509-544Crossref PubMed Scopus (5064) Google Scholar). Camgaroo-1 had the desirable feature of a rather large (∼7-fold) increase in fluorescence in response to Ca2+binding, but it unfortunately expressed poorly at 37 °C and could not be targeted to organelles such as mitochondria (34Baird G.S. Zacharias D.A. Tsien R.Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 11241-11246Crossref PubMed Scopus (770) Google Scholar). We therefore randomly mutated the cDNA encoding camgaroo-1 by error-prone PCR, transformed the resulting library into E. coli, and screened colonies grown at 37 °C for maximal fluorescence. Sequencing of the brightest clones (camgaroo-2) revealed just one new mutation, replacement of residue 69 (Gln in wild type, Lys in EYFP V68L/Q69K) by Met. The excitation and emission maxima as well as the response toin vitro titration with Ca2+ (5.3 ± 0.3 µm apparent dissociation constant, Hill coefficient 1.24, fluorescence enhancement of ∼7-fold) (Fig.1 A) were much the same as for camgaroo-1. However, camgaroo-2 produced far brighter expression in HeLa cells grown at 37 °C, where it filled the cytosol and nucleus uniformly (Fig. 1 B). Stimulation of the cells with histamine produced only about 5% intensity increase (Fig. 1 C), consistent with the bias of camgaroos toward higher amplitude [Ca2+] transients. A saturating elevation of cytosolic [Ca2+] induced with ionomycin increased the fluorescence about 6-fold (Fig. 1 C). We also targeted camgaroo-2 to mitochondria using the pECFP-Mito vector (CLONTECH), which uses the targeting sequence of subunit VIII of cytochrome c oxidase. Transfected cells showed a pattern typical of mitochondria (Fig. 1 D), indistinguishable from that of the accepted mitochondrial marker rhodamine 123 (data not shown). Camgaroo-2 is functional in mitochondria because a response to histamine was detected and ionomycin produced a significant fluorescence increase, although lower in dynamic range than in the cytosol (Fig. 1 E). The desirable effects of mutation Q69M in camgaroo-2 prompted transfer of this same mutation into EYFP V68L/Q69K not containing any inserted proteins. This improved variant of YFP, i.e. Citrine, has excitation and emission peaks of 516 and 529 nm, respectively, a quantum yield of 0.76, and an extinction coefficient of 7.7 × 104 (Table I). These properties are comparable to those of previous YFPs. One unexpected spectroscopic difference is that Citrine photobleaches at about half the rate as EYFP V68L/Q69K (Fig.2 A). Based on the illumination intensity of 1.9 W/cm2, we estimate the photobleaching quantum yield of Citrine to be about 2.3 × 10−5, in surprisingly good agreement with an estimate of 2.6 × 10−5 obtained at much higher illumination intensities (35Heikal A.A. Hess S.T. Baird G.S. Tsien R.Y. Webb W.W. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 11996-12001Crossref PubMed Scopus (300) Google Scholar). The corresponding value for EYFP V68L/Q69K is 5 × 10−5 from Fig. 2 A and Ref. 42Baird G.S. Zacharias D.A. Tsien R.Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 11984-11989Crossref PubMed Scopus (795) Google Scholar. Citrine also has a considerably lower pK a, 5.7, than previous YFPs such as EYFP V68L/Q69K (Fig. 2 B and Table I) making it less sensitive to fluctuations in intracellular pH. Cytosolic pH can range from ∼7.3 to 6.8, depending on cell type and stimulation (43Chesler M. Kaila K. Trends Neurosci. 1992; 15: 396-402Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (485) Google Scholar), so cytosolic Citrine should not be expected to vary in fluorescence during normal physiological stimulation. Furthermore, pH titrations were the same in 100 mm potassium chloride and 100 mmsodium gluconate (Fig. 2 B), indicating that Citrine is not perturbed by chloride. The pK a values of all previous YFPs increase with increasing halide concentrations (10Wachter R.M. Yarbrough D. Kallio K. Remington S.J. J. Mol. Biol. 2000; 301: 157-171Crossref PubMed Scopus (136) Google Scholar, 11Wachter R.M. Remington S.J. Curr. Biol. 1999; 9: R628-R629Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (143) Google Scholar, 12Jayaraman S. Haggie P. Wachter R.M. Remington S.J. Verkman A.S. J. Biol. Chem. 2000; 275: 6047-6050Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (261) Google Scholar). For example, Fig. 2 B also shows the chloride dependence of EYFP V68L/Q69K, which is actually one of the less halide-sensitive YFPs. Citrine folded efficiently at 37 °C, and with appropriate targeting sequences, could be expressed in the endoplasmic reticulum of HeLa cells. In contrast, EYFP V68L/Q69K did not tolerate attachment of ER-targeting sequences, and remained mostly nonfluorescent, with sporadic cells showing cytosolic fluorescence (data not shown). In addition, circular permutations of Citrine were observed to develop fluorescence at 37 °C (Table I), in contrast to comparable permutations of EYFP V68L/Q69K that become fluorescent only at 20 °C or less. In summary, the Q69M mutation improves many of the shortcomings of YFP including pH and chloride sensitivity as well as the inability to fold well in organelles or as a circular permutation.Table ISpectral properties and pKa of selected YFP variantsλex1-aExcitation maximum (nm).λcm1-bEmission maximum (nm).ε1-cExtinction coefficient (m−1 cm−1).Quantum yieldpK a1-dDetermined in 147 mmchloride. (147 mmCl−)pK a1-eDetermined in 147 mmgluconate. (no Cl−)Citrine51652977 × 1030.765.75.7Citrine-C48L/C70V51652969 × 1030.725.7ND1-fND, not determined.cpCitrine1-gCircularly permuted Citrine.50652420 × 1030.107.7NDEYFP V68L/Q69K51652962 × 1030.716.16.0cpEYFP V68L/Q69K1-hCircularly permuted EYFP V68L/Q69K.50652418 × 1030.098.9ND1-a Excitation maximum (nm).1-b Emission maximum (nm).1-c Extinction coefficient (m−1 cm−1).1-d Determined in 147 mmchloride.1-e Determined in 147 mmgluconate.1-f ND, not determined.1-g Circularly permuted Citrine.1-h Circularly permuted EYFP V68L/Q69K. Open table in a new tab To investigate why the mutation Q69M improves YFPs chloride and pH resistance, we determined the x-ray structure of Citrine at 2.2-Å resolution (Table II and PDB accession code 1HUY). As expected, the effect of the Q69M mutation on the overall structure of YFP is minor. The root mean square deviation between Citrine and the same protein with Gln at 69 (PDB accession code 1YFP) is 0.32 Å (3Wachter R.M. Elsliger M.-A. Kallio K. Hanson G.T. Remington S.J. Structure. 1998; 6: 1267-1277Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (371) Google Scholar). In the immediate vicinity of the chromophore and the adjacent Met69 residue, small positional shifts (on the order of 0.3 Å when compared with 1YFP) resulting from the introduction of the bulky methionine side chain are apparent (Fig.3 A). There is a localized slight outward displacement of the two closest strands of the β-barrel due to steric contact of the side chains of residues Val150 and Leu201 with the methionine. Additional residues in the local environment, including the chromophore and its π-stacked partner Tyr203, have undergone compensatory shifts and thus the majority of the packing interactions and hydrogen bond network are unchanged.Table IIData collection and refinement statisticsData collectionResolution (Å)2-aNumbers in parentheses refer to the highest resolution shell.28.3–2.2 (2.28–2.20)No. of reflection

Cameleons are genetically-encoded fluorescent indicators for Ca 2+ based on green fluorescent protein variants and calmodulin (CaM). Because cameleons can be targeted genetically and imaged by one- or two-photon excitation microscopy, they offer great promise for monitoring Ca 2+ in whole organisms, tissues, organelles, and submicroscopic environments in which measurements were previously impossible. However, the original cameleons suffered from significant pH interference, and their Ca 2+ -buffering and cross-reactivity with endogenous CaM signaling pathways was uncharacterized. We have now greatly reduced the pH-sensitivity of the cameleons by introducing mutations V68L and Q69K into the acceptor yellow green fluorescent protein. The resulting new cameleons permit Ca 2+ measurements despite significant cytosolic acidification. When Ca 2+ is elevated, the CaM and CaM-binding peptide fused together in a cameleon predominantly interact with each other rather than with free CaM and CaM-dependent enzymes. Therefore, if cameleons are overexpressed, the primary effect is likely to be the unavoidable increase in Ca 2+ buffering rather than specific perturbation of CaM-dependent signaling.

The quality of genetically encoded calcium indicators (GECIs) has improved dramatically in recent years, but high-performing ratiometric indicators are still rare. Here we describe a series of fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based calcium biosensors with a reduced number of calcium binding sites per sensor. These 'Twitch' sensors are based on the C-terminal domain of Opsanus troponin C. Their FRET responses were optimized by a large-scale functional screen in bacterial colonies, refined by a secondary screen in rat hippocampal neuron cultures. We tested the in vivo performance of the most sensitive variants in the brain and lymph nodes of mice. The sensitivity of the Twitch sensors matched that of synthetic calcium dyes and allowed visualization of tonic action potential firing in neurons and high resolution functional tracking of T lymphocytes. Given their ratiometric readout, their brightness, large dynamic range and linear response properties, Twitch sensors represent versatile tools for neuroscience and immunology.

Second messenger-induced Ca2+-release from intracellular stores plays a key role in a multitude of physiological processes. In addition to 1,4,5-inositol trisphosphate (IP3), Ca2+, and cyclic ADP ribose (cADPR) that trigger Ca2+-release from the endoplasmatic reticulum (ER), nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate (NAADP) has been identified as a cellular metabolite that mediates Ca2+-release from lysosomal stores. While NAADP-induced Ca2+-release has been found in many tissues and cell types, the molecular identity of the channel(s) conferring this release remained elusive so far. Here, we show that TPCN2, a novel member of the two-pore cation channel family, displays the basic properties of native NAADP-dependent Ca2+-release channels. TPCN2 transcripts are widely expressed in the body and encode a lysosomal protein forming homomers. TPCN2 mediates intracellular Ca2+-release after activation with low-nanomolar concentrations of NAADP while it is desensitized by micromolar concentrations of this second messenger and is insensitive to the NAADP analog nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP). Furthermore, TPCN2-mediated Ca2+-release is almost completely abolished when the capacity of lysosomes for storing Ca2+ is pharmacologically blocked. By contrast, TPCN2-specific Ca2+-release is unaffected by emptying ER-based Ca2+ stores. In conclusion, these findings indicate that TPCN2 is a major component of the long-sought lysosomal NAADP-dependent Ca2+-release channel.

Abstract Ca 2+ influx into the trans-Golgi Network (TGN) promotes secretory cargo sorting by the Ca 2+ -ATPase SPCA1 and the luminal Ca 2+ binding protein Cab45. Cab45 oligomerizes upon a local Ca 2+ influx, and Cab45 oligomers sequester and separate soluble secretory cargo from the bulk flow of proteins in the TGN. However, how this Ca 2+ flux into the lumen of the TGN is achieved remains elusive, as the cytosol has a very low steady-state Ca 2+ concentration. The TGN forms membrane contact sites (MCS) with the Endoplasmic Reticulum (ER), whereby the close apposition of the two organelles allows the protein-mediated exchange of molecular species such as lipids. Here we show that the TGN export of Cab45 clients requires the integrity of ER-TGN MCS and IP3R-dependent Ca 2+ fluxes in the MCS, suggesting Ca 2+ transfer between these organelles. Using an MCS-targeted Ca 2+ FRET sensor module, we measure the Ca 2+ flow in these sites in real-time. These data show for the first time that ER-TGN MCS facilitates Ca 2+ transfer required for SPCA1-dependent cargo sorting and export from the TGN, thus solving a fundamental question in cell biology. Summary The current study demonstrates that the trafficking of COMP and LyzC relies on Ca 2+ flux between the endoplasmic reticulum (ER) and trans-Golgi Network (TGN). This process requires the activity of IP3 receptors, present in ER membranes, and depends on the integrity of the membrane contact site between these two organelles.

In mammalian ovarian follicles, follicle stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH) signal primarily through the G-protein Gs to elevate cAMP, but both of these hormones can also elevate Ca2+ under some conditions. Here we investigate FSH- and LH-induced Ca2+ signaling in intact follicles of mice expressing genetically encoded Ca2+ sensors, Twitch-2B and GCaMP6s. At a physiological concentration (1 nM), FSH elevates Ca2+ within the granulosa cells of preantral and antral follicles. The Ca2+ rise begins several minutes after FSH application, peaks at ~10 minutes, remains above baseline for another ~10 minutes, and depends on extracellular Ca2+. However, suppression of the FSH-induced Ca2+ increase by reducing extracellular Ca2+ does not inhibit FSH-induced phosphorylation of MAP kinase, estradiol production, or the acquisition of LH responsiveness. Like FSH, LH also increases Ca2+, when applied to preovulatory follicles. At a physiological concentration (10 nM), LH elicits Ca2+ oscillations in a subset of cells in the outer mural granulosa layer. These oscillations continue for at least 6 hours and depend on the activity of Gq family G-proteins. Suppression of the oscillations by Gq inhibition does not inhibit meiotic resumption, but does slightly attenuate ovulation. In summary, both FSH and LH increase Ca2+ in the granulosa cells of intact follicles, but the functions of these Ca2+ rises are only starting to be identified.