A high tumour mutational burden (hypermutation) is observed in some gliomas1–5; however, the mechanisms by which hypermutation develops and whether it predicts the response to immunotherapy are poorly understood. Here we comprehensively analyse the molecular determinants of mutational burden and signatures in 10,294 gliomas. We delineate two main pathways to hypermutation: a de novo pathway associated with constitutional defects in DNA polymerase and mismatch repair (MMR) genes, and a more common post-treatment pathway, associated with acquired resistance driven by MMR defects in chemotherapy-sensitive gliomas that recur after treatment with the chemotherapy drug temozolomide. Experimentally, the mutational signature of post-treatment hypermutated gliomas was recapitulated by temozolomide-induced damage in cells with MMR deficiency. MMR-deficient gliomas were characterized by a lack of prominent T cell infiltrates, extensive intratumoral heterogeneity, poor patient survival and a low rate of response to PD-1 blockade. Moreover, although bulk analyses did not detect microsatellite instability in MMR-deficient gliomas, single-cell whole-genome sequencing analysis of post-treatment hypermutated glioma cells identified microsatellite mutations. These results show that chemotherapy can drive the acquisition of hypermutated populations without promoting a response to PD-1 blockade and supports the diagnostic use of mutational burden and signatures in cancer. Temozolomide therapy seems to lead to mismatch repair deficiency and hypermutation in gliomas, but not to an increase in response to immunotherapy.

Prognostically relevant RNA expression states exist in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), but our understanding of their drivers, stability, and relationship to therapeutic response is limited.To examine these attributes systematically, we profiled metastatic biopsies and matched organoid models at single-cell resolution.In vivo, we identify a new intermediate PDAC transcriptional cell state and uncover distinct site-and state-specific tumor microenvironments (TMEs).Benchmarking models against this reference map, we reveal strong culture-specific biases in cancer cell transcriptional state representation driven by altered TME signals.We restore expression state heterogeneity by adding back in vivo-relevant factors and show plasticity in culture models.Further, we prove that non-genetic modulation of cell state can strongly influence drug responses, uncovering state-specific vulnerabilities.This work provides a broadly applicable framework for aligning cell states across in vivo and ex vivo settings, identifying drivers of transcriptional plasticity and manipulating cell state to target associated vulnerabilities.

SUMMARY Bulk transcriptomic studies have defined classical and basal-like gene expression subtypes in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) that correlate with survival and response to chemotherapy; however, the underlying mechanisms that govern these subtypes and their heterogeneity remain elusive. Here, we performed single-cell RNA-sequencing of 23 metastatic PDAC needle biopsies and matched organoid models to understand how tumor cell-intrinsic features and extrinsic factors in the tumor microenvironment (TME) shape PDAC cancer cell phenotypes. We identify a novel cancer cell state that co-expresses basal-like and classical signatures, demonstrates upregulation of developmental and KRAS-driven gene expression programs, and represents a transitional intermediate between the basal-like and classical poles. Further, we observe structure to the metastatic TME supporting a model whereby reciprocal intercellular signaling shapes the local microenvironment and influences cancer cell transcriptional subtypes. In organoid culture, we find that transcriptional phenotypes are plastic and strongly skew toward the classical expression state, irrespective of genotype. Moreover, we show that patient-relevant transcriptional heterogeneity can be rescued by supplementing organoid media with factors found in the TME in a subtype-specific manner. Collectively, our study demonstrates that distinct microenvironmental signals are critical regulators of clinically relevant PDAC transcriptional states and their plasticity, identifies the necessity for considering the TME in cancer modeling efforts, and provides a generalizable approach for delineating the cell-intrinsic versus -extrinsic factors that govern tumor cell phenotypes.

Abstract The genomic drivers of immune exclusion in colorectal cancer liver metastases (CRCLM) remain poorly understood. Chromosomal instability (CIN), resulting in aneuploidy and genomic rearrangements, is the central pathway of mismatch repair-proficient colorectal cancer pathogenesis; however, it is unknown whether CIN impacts the outcomes of patients with limited spread of CRCLM treated with curative intent cytotoxic chemotherapy and surgery. Herein, we examined the relationship between CIN and the molecular subtypes of CRCLM, immune signaling, treatment sensitivity, and patient outcomes in three independent CRCLM patient cohorts. We established that a previously developed 70-gene CIN signature (CIN70) is a reliable measure of CIN, encompassing features of both aneuploidy and cellular proliferation. We demonstrated that tumors with the canonical subtype of CRCLM exhibit elevated levels of CIN and aneuploidy. Genomically unstable tumors were associated with an immune-depleted tumor microenvironment, and patients with genomically unstable tumors were at increased risk for disease progression in adverse metastatic sites, resulting in poor progression-free and overall survival. However, high-CIN tumors were particularly susceptible to DNA-damaging chemotherapies, including topoisomerase inhibitors, as well as radiation therapy. Treatment with genotoxic agents depleted CIN-rich cell populations, which resulted in a concomitant increase in intratumoral CD8+ T-cells in patients with primary rectal, breast, and bladder cancer. Taken together, we propose a mechanistic explanation for why cytotoxic chemotherapy can augment anti-tumor immunity and improve outcomes in patients with genomically unstable cancers.

Abstract Recently, pioneering eQTLs studies on single cell RNA-seq (scRNA-seq) data have revealed new and cell-specific regulatory SNVs. Because eQTLs correlate genotypes and gene expression across multiple individuals, they are confined to SNVs with sufficient population frequency. Here, we present an alternative sc-eQTL approach – scReQTL - wherein we substitute the genotypes with expressed Variant Allele Fraction (VAF RNA ) at heterozygous SNV sites. Our approach employs the advantage that, when estimated from multiple cells, VAF RNA can be used to assess effects of rare SNVs in a single individual. ScReQTLs are enriched in known genetic interactions, therefore can be used to identify novel regulatory SNVs.

Summary: RsQTL is a tool for identification of splicing quantitative trait loci (sQTLs) from RNA-sequencing (RNA-seq) data by correlating the variant allele fraction at expressed SNV loci in the transcriptome (VAFRNA) with the proportion of molecules spanning local exon-exon junctions at loci with differential intron excision (percent spliced in, PSI). We exemplify the method on sets of RNA-seq data from human tissues obtained though the Genotype-Tissue Expression Project (GTEx). RsQTL does not require matched DNA and can identify a subset of expressed sQTL loci. Due to the dynamic nature of VAFRNA, RsQTL is applicable for the assessment of conditional and dynamic variation-splicing relationships. Availability and implementation: https://github.com/HorvathLab/RsQTL.

ABSTRACT Background Inflammatory breast cancer (IBC) is a rare and poorly characterized type of breast cancer with an aggressive clinical presentation. The biological mechanisms driving the IBC phenotype are relatively undefined—partially due to a lack of comprehensive, large-scale genomic studies and limited clinical cohorts. Patients and Methods A retrospective analysis of 2457 patients with metastatic breast cancer who underwent targeted tumor-only DNA-sequencing was performed at Dana-Farber Cancer Institute. Clinicopathologic, single nucleotide variant (SNV), copy number variant (CNV) and tumor mutational burden (TMB) comparisons were made between clinically confirmed IBC cases within a dedicated IBC center versus non-IBC cases. Results Clinicopathologic differences between IBC and non-IBC cases were consistent with prior reports—including IBC being associated with younger age at diagnosis, higher grade, and enrichment with hormone receptor (HR)-negative and HER2-positive tumors. The most frequent somatic alterations in IBC involved TP53 (72%), ERBB2 (32%), PIK3CA (24%), CCND1 (12%), MYC (9%), FGFR1 (8%) and GATA3 (8%). A multivariate logistic regression analysis revealed a significant enrichment in TP53 SNVs in IBC; particularly in HER2-positive and HR-positive disease which was associated with worse outcomes. Tumor mutational burden (TMB) did not differ substantially between IBC and non-IBC cases and a pathway analysis revealed an enrichment in NOTCH pathway alterations in HER2-positive disease. Conclusion Taken together, this study provides a comprehensive, clinically informed landscape of somatic alterations in a large cohort of patients with IBC. Our data support higher frequency of TP53 mutations and a potential enrichment in NOTCH pathway activation—but overall; a lack of major genomic differences. These results both reinforce the importance of TP53 alterations in IBC pathogenesis as well as their influence on clinical outcomes; but also suggest additional analyses beyond somatic DNA-level changes are warranted.

With the significant shift in the classification, risk stratification, and standards of care for gliomas, we sought to understand how the overall survival of patients with these tumors is impacted by molecular features, clinical metrics, and treatment received.

Motivation: By testing for association of DNA genotypes with gene expression levels, expression quantitative trait locus (eQTL) analyses have been instrumental in understanding how thousands of single nucleotide variants (SNVs) may affect gene expression. As compared to DNA genotypes, RNA genetic variation represents a phenotypic trait that reflects the actual allele content of the studied system. RNA genetic variation can be measured at expressed genome regions, and differs from the DNA genotype in sites subjected to regulatory forces. Therefore, assessment of correla-tion between RNA genetic variation and gene expression can reveal regulatory genomic relationships in addition to eQTLs. Results: We introduce ReQTL, an eQTL modification which substitutes the DNA allele count for the variant allele frequency (VAF) at expressed SNV loci in the transcriptome. We exemplify the method on sets of RNA-sequencing data from human tissues obtained though the Genotype-Tissue Expression Project (GTEx) and demonstrate that ReQTL analyses show consistently high performance and sufficient power to identify both previously known and novel molecu-lar associations. The majority of the SNVs implicated in significant cis-ReQTLs identified by our analysis were previous-ly reported as significant cis-eQTL loci. Notably, trans ReQTL loci in our data were substantially enriched in RNA-editing sites. In summary, ReQTL analyses are computationally feasible and do not require matched DNA data, hence they have a high potential to facilitate the discovery of novel molecular interactions through exploration of the increasingly accessible RNA-sequencing datasets. Availability and implementation: Sample scripts used in our ReQTL analyses are available with the Supplemen-tary Material (ReQTL_sample_code).