Abstract Two-photon voltage imaging has long been heralded as a transformative approach capable of answering many long-standing questions in modern neuroscience. However, exploiting its full potential requires the development of novel imaging approaches well suited to the photophysical properties of genetically encoded voltage indicators. We demonstrate that parallel excitation approaches developed for scanless two-photon photostimulation enable high-SNR two-photon voltage imaging. We use whole-cell patch-clamp electrophysiology to perform a thorough characterization of scanless two-photon voltage imaging using three parallel illumination approaches and lasers with different repetition rates and wavelengths. We demonstrate voltage recordings of high-frequency spike trains and sub-threshold depolarizations from neurons expressing the soma-targeted genetically encoded voltage indicator JEDI-2P-Kv. Using a low repetition-rate laser, we perform multi-cell recordings from up to fifteen targets simultaneously. We co-express JEDI-2P-Kv and the channelrhodopsin ChroME-ST and capitalize on their overlapping two-photon absorption spectra to simultaneously evoke and image action potentials using a single laser source. We also demonstrate in vivo scanless two-photon imaging of multiple cells simultaneously up to 250 µm deep in the barrel cortex of head-fixed, anaesthetised mice.

Volumetric super-resolution microscopy typically encodes the 3D position of single-molecule fluorescence into a 2D image by changing the shape of the point spread function (PSF) as a function of depth. However, the resulting large and complex PSF spatial footprints reduce temporal resolution by requiring lower labelling densities to avoid overlapping fluorescent signals. We quantitatively compare the density dependence of single-molecule light field microscopy (SMLFM) to other 3D PSFs (astigmatism, double helix and tetrapod) showing that SMFLM enables an order-of-magnitude speed improvement compared to the double helix PSF by resolving overlapping emitters through parallax. We then experimentally demonstrate the high accuracy (>99.2 ± 0.1%, 0.1 locs μm −2 ) and sensitivity (>86.6 ± 0.9%, 0.1 locs μm −2 ) of SMLFM at point detection through whole-cell (scan-free) imaging and tracking of single membrane proteins in live primary B cells. We also exemplify high density volumetric imaging (0.15 locs μm −2 ) in dense cytosolic tubulin datasets.

Abstract The recent advances in sophisticated optical techniques, coupled with two-photon sensitive genetic voltage indicators (GEVIs), have enabled in-depth voltage imaging in vivo at single spike and single-cell resolution. To date, these results have been only achieved using ASAP-type sensors, as the complex photocycle of rhodopsin-based voltage indicators posed challenges for their two-photon use, restricting their application to one-photon approaches. In this work, we demonstrate that rhodopsin-based GEVIs (FRET-opsin) can be used under two-photon illumination when their peculiar light intensity dependence of kinetics and sensitivity are considered. We rationally engineer a fully genetically-encoded, rhodopsin-based voltage indicator with the brightest known fluorophore AaFP1, Jarvis, and demonstrate its utility under both one- and two-photon illumination. We also showed two-photon usability of the similar FRET-opsin sensor pAce. Our comparison of 2P scanless with fast 2P scanning illumination revealed that the latter approach is less suitable for this class of indicators and, on the contrary, both sensors responded well when scanless approaches were used. Furthermore, utilising Jarvis, we demonstrated high-fidelity, high-SNR action potential detection at kilohertz-imaging rates both in mouse hippocampal slices and in zebrafish larvae. To the best of our knowledge, this study represents the first report of a fully genetically-encoded rhodopsin-based voltage indicator for high contrast action potential detection under two-photon illumination in vitro and in vivo .

We introduce single molecule light field microscopy (SMLFM), a novel 3D single molecule localization technique that is capable of up to 20 nm isotropic precision across a 6 μ m depth of field. SMLFM can be readily implemented by installing a refractive microlens array into the conjugate back focal plane of any widefield single molecule localization system. We demonstrate that 3D localization can be performed by post-processing 2D localization data generated by common, widely-used, algorithms. In this work we benchmark the performance of SMLFM and finally showcase its capabilities by imaging fluorescently labeled membranes of fixed eukaryotic cells below the diffraction limit.