NMDA receptors require both L-glutamate and the coagonist glycine for efficient channel activation. The glycine binding site of these heteromeric receptor proteins is formed by regions of the NMDAR1 (NR1) subunit that display sequence similarity to bacterial amino acid binding proteins. Here, we demonstrate that the glutamate binding site is located on the homologous regions of the NR2B subunit. Mutation of residues within the N-terminal domain and the loop region between membrane segments M3 and M4 significantly reduced the efficacy of glutamate, but not glycine, in channel gating. Some of the mutations also decreased inhibition by the glutamate antagonists, D-AP5 and R-CPP. Homology-based molecular modeling of the glutamate and glycine binding domains indicates that the NR2 and NR1 subunits use similar residues to ligate the agonists' α-aminocarboxylic acid groups, whereas differences in side chain interactions and size of aromatic residues determine ligand selectivity.

Abstract Transcranical direct current stimulation (tDCS) is a treatment known to ameliorate various neurological conditions and enhance memory and cognition in humans. tDCS has gained traction for its potential therapeutic value; however, little is known about its mechanism of action. Using a transgenic mouse expressing G-CaMP7 in astrocytes and a subpopulation of excitatory neurons, we find that tDCS induces large-amplitude astrocytic Ca 2+ surges across the entire cortex with no obvious changes in the local field potential. Moreover, sensory evoked cortical responses are enhanced after tDCS. These enhancements are dependent on the alpha-1 adrenergic receptor and are not observed in IP 3 R2 (inositol trisphosphate receptor type 2) knockout mice, in which astrocytic Ca 2+ surges are absent. Together, we propose that tDCS changes the metaplasticity of the cortex through astrocytic Ca 2+ /IP 3 signalling.

Abstract Improved understanding of the mechanisms involved in neurodegenerative disease has been hampered by the lack of robust cellular models that faithfully replicate in vivo features. Here, we present a refined protocol for generating age-dependent, well-developed and synaptically active rat Purkinje neurons, responsive to paracrine factors and supporting a 3D cell network. Our model provides high experimental flexibility, high-throughput screening capabilities and reliability to elucidate Purkinje neuron function, communication and neurodegenerative mechanisms.

Summary The adult brain can flexibly adapt behaviors to specific life-stage demands. For example, while sexually naïve male mice are aggressive to the conspecific young, they start to provide caregiving to infants around the time when their own young are expected. How such behavioral plasticity is implemented at the level of neural connections remains poorly understood. Using viral-genetic approaches, here we establish hypothalamic oxytocin neurons as key regulators of parental caregiving behaviors of male mice. We then used rabies virus-mediated unbiased screen to identify excitatory neural connections originating from the lateral hypothalamus to the oxytocin neurons to be drastically strengthened when male mice become fathers. These connections are functionally relevant, as their activation suppresses pup-directed aggression in virgin males. These results demonstrate the life-stage associated, long-distance, and cell-type-specific plasticity of neural connections in the hypothalamus, the brain region classically assumed to be hard-wired. Highlight – OT is indispensable for parental caregiving behavior of male mice – Activation of OT neurons triggers paternal caregiving behavior in otherwise infanticidal sexually-naïve male mice partly via OT ligand – Unbiased rabies virus-mediated screening reveals enhanced connectivity originated from excitatory LHA neurons to OT neurons in fathers. – This structural plasticity can support behavioral plasticity

Abstract To achieve cell type-specific gene expression, using target cell-tropic AAV capsids is advantageous. However, their tropism across brain cell types remains unexplored in non-human primates. We assessed the tropism of nine AAV serotype capsids (AAV1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, rh.10 (rh10), and DJ) on marmoset cerebral cortical cell types. Marmoset cerebral cortex was injected with different serotype AAVs expressing enhanced GFP (EGFP) by the ubiquitous chicken β-actin hybrid (CBh) promoter. After 4 weeks, all nine AAV capsid vectors, especially AAV9 and AAVrh10, caused highly neuron-selective EGFP expression. Some AAV capsids, including AAV5, caused EGFP expression in oligodendrocytes to a lesser extent, with minimal or no expression in astrocytes and microglia. Different ubiquitous CMV and CAG promoters showed similar neuron-predominant transduction. Conversely, all nine AAV capsid vectors with the astrocyte-specific hGFA(ABC1D) promoter selectively transduced astrocytes, except AAV5, which transduced oligodendrocytes modestly. Oligodendrocyte-specific mouse myeline basic protein (mMBP) promoter in AAV5 vectors transduced oligodendrocytes specifically and efficiently. Our results suggest optimal combinations of capsids and promoters for cell type-specific expression: AAV9 or AAVrh10 and ubiquitous CBh, CMV, or CAG promoter for neuron-specific transduction; AAV2 or 7 and hGFA(ABC1D) promoter for astrocyte-specific transduction; and AAV5 and mMBP promoter for oligodendrocyte-specific transduction.

Albumin, a protein produced by liver hepatocytes, represents the most abundant protein in blood plasma. We have previously engineered a liver-targeting adeno-associated viral vector (AAV) that expresses fluorescent protein-tagged albumin to visualize blood plasma in mice. While this approach is versatile for imaging in adult mice, transgene expression vanishes when AAV is administered in neonates due to dilution of the episomal AAV genome in the rapidly growing liver. Here, we use CRISPR/Cas9 genome editing to insert the fluorescent protein mNeonGreen (mNG) gene into the albumin (Alb) locus of hepatocytes to produce fluorescently labeled albumin (Alb-mNG). We constructed a CRISPR AAV that includes ∼1 kb homologous arms around Alb exon 14 to express Alb-mNG. Subcutaneous injection of this AAV with AAV-CMV-Cas9 in postnatal day 3 mice resulted in two-photon visualization of the cerebral cortex vasculature within ten days. The expression levels of Alb-mNG were persistent for at least three months and were so robust that vasomotion and capillary blood flow could be assessed transcranially in early postnatal mice. This knock-in approach provides powerful means for micro- and macroscopic imaging of cerebral vascular dynamics in postnatal and adult mice.

Abstract Studying blood microcirculation is vital for gaining insights into vascular diseases. Acute administration of fluorescent tracers is currently used for deep tissue blood flow imaging. This is invasive, and the plasma fluorescence decreases within an hour of administration. We report a novel approach for the longitudinal study of vasculature. Using a single systemic administration of viral vectors, we express fluorescent secretory albumin-fusion proteins in the liver to label the blood in mice. All segments of the vasculature in brain and peripheral tissue are observable by two-photon microscopy within two weeks of vector administration. This approach allows for observation of circulation without the need for repeated administration for several months. We demonstrate the chronic assessment of vascular functions at micro-and mesoscopic scales. This genetic plasma labeling approach represents a versatile and cost-effective method for the chronic investigation of vasculature functions across the body in health and disease.

Abstract Breastfeeding, which is essential for the survival of mammalian infants, is critically mediated by pulsatile secretion of the pituitary hormone oxytocin from the central oxytocin neurons located in the paraventricular and supraoptic hypothalamic nuclei of mothers. Despite its importance, the molecular and neural circuit mechanisms of the milk ejection reflex remain poorly understood, in part because a mouse model to study lactation was only recently established. In our previous study, we successfully introduced fiber photometry-based chronic imaging of the pulsatile activities of oxytocin neurons during lactation. However, the necessity of Cre recombinase-based double knock-in mice substantially compromised the use of various Cre-dependent neuroscience toolkits. To overcome this obstacle, we developed a simple Cre-free method for monitoring oxytocin neurons by an adeno-associated virus vector driving GCaMP6s under a 2.6 kb mouse oxytocin mini-promoter. Using this method, we monitored calcium ion transients of oxytocin neurons in the paraventricular nucleus in wild-type C57BL/6N and ICR mothers without genetic crossing. By combining this method with video recordings of mothers and pups, we found that the pulsatile activities of oxytocin neurons require physical mother–pup contact for the milk ejection reflex. Notably, the frequencies of photometric signals were dynamically modulated by mother–pup reunions after isolation and during natural weaning stages. Collectively, the present study illuminates the temporal dynamics of pulsatile activities of oxytocin neurons in wild-type mice and provides a tool to characterize maternal oxytocin functions.

Summary When processing current sensory inputs, animals refer to related past experiences. Current information is then incorporated into the related neural network to update previously stored memories. However, the neuronal mechanism underlying the impact of memories of prior experiences on current learning is not well understood. Here, we found that a cellular ensemble in the posterior parietal cortex (PPC) that is activated during past experience mediates an interaction between past and current information to update memory through a PPC-anterior cingulate cortex circuit in mice. Moreover, optogenetic silencing of the PPC ensemble immediately after retrieval dissociated the interaction without affecting individual memories stored in the hippocampus and amygdala. Thus, a specific subpopulation of PPC cells represents past information and instructs downstream brain regions to update previous memories.