The active form of vitamin D, 1alpha,25-dihydroxyvitamin D [1alpha,25(OH)2D], is synthesized from its precursor 25 hydroxyvitamin D [25(OH)D] via the catalytic action of the 25(OH)D-1alpha-hydroxylase [1alpha(OH)ase] enzyme. Many roles in cell growth and differentiation have been attributed to 1,25(OH)2D, including a central role in calcium homeostasis and skeletal metabolism. To investigate the in vivo functions of 1,25(OH)2D and the molecular basis of its actions, we developed a mouse model deficient in 1alpha(OH)ase by targeted ablation of the hormone-binding and heme-binding domains of the 1alpha(OH)ase gene. After weaning, mice developed hypocalcemia, secondary hyperparathyroidism, retarded growth, and the skeletal abnormalities characteristic of rickets. These abnormalities are similar to those described in humans with the genetic disorder vitamin D dependent rickets type I [VDDR-I; also known as pseudovitamin D-deficiency rickets (PDDR)]. Altered non-collagenous matrix protein expression and reduced numbers of osteoclasts were also observed in bone. Female mutant mice were infertile and exhibited uterine hypoplasia and absent corpora lutea. Furthermore, histologically enlarged lymph nodes in the vicinity of the thyroid gland and a reduction in CD4- and CD8-positive peripheral T lymphocytes were observed. Alopecia, reported in vitamin D receptor (VDR)-deficient mice and in humans with VDDR-II, was not seen. The findings establish a critical role for the 1alpha(OH)ase enzyme in mineral and skeletal homeostasis as well as in female reproduction and also point to an important role in regulating immune function.

In mice, natural resistance or susceptibility to infection with intracellular parasites is determined by a locus or group of loci on chromosome 1, designated Bcg, Lsh, and Ity, which controls early microbial replication in reticuloendothelial organs. We have identified by positional cloning a candidate gene for Bcg, Nramp1, which codes for a novel macrophage-specific membrane transport protein. We have created a mouse mutant bearing a null allele at Nramp1, and we have analyzed the effect of such a mutation on natural resistance to infection. Targeted disruption of Nramp1 has pleiotropic effects on natural resistance to infection with intracellular parasites, as it eliminated resistance to Mycobacterium bovis, Leishmania donovani, and lethal Salmonella typhimurium infection, establishing that Nramp1, Bcg, Lsh, and Ity are the same locus. Comparing the profiles of parasite replication in control and Nramp1-/- mice indicated that the Nramp1Asp169 allele of BcgS inbred strains is a null allele, pointing to a critical role of this residue in the mechanism of action of the protein. Despite their inability to control parasite growth in the early nonimmune phase of the infection, Nramp1-/- mutants can overcome the infection in the late immune phase, suggesting that Nramp1 plays a key role only in the early part of the macrophage-parasite interaction and may function by a cytocidal or cytostatic mechanism distinct from those expressed by activated macrophages.

Common obesity is primarily characterized by resistance to the actions of the hormone leptin. Mice deficient in protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) are resistant to diabetes and diet-induced obesity, prompting us to further define the relationship between PTP1B and leptin in modulating obesity. Leptin-deficient (Lepob/ob) mice lacking PTP1B exhibit an attenuated weight gain, a decrease in adipose tissue, and an increase in resting metabolic rate. Furthermore, PTP1B-deficient mice show an enhanced response toward leptin-mediated weight loss and suppression of feeding. Hypothalami from these mice also display markedly increased leptin-induced Stat3 phosphorylation. Finally, substrate-trapping experiments demonstrate that leptin-activated Jak2, but not Stat3 or the leptin receptor, is a substrate of PTP1B. These results suggest that PTP1B negatively regulates leptin signaling, and provide one mechanism by which it may regulate obesity.

Upon interferon (IFN) stimulation, Stat1 becomes tyrosine phosphorylated and translocates into the nucleus, where it binds to DNA to activate transcription.The activity of Stat1 is dependent on tyrosine phosphorylation, and its inactivation in the nucleus is accomplished by a previously unknown protein tyrosine phosphatase (PTP).We have now purified a Stat1 PTP activity from HeLa cell nuclear extract and identified it as TC45, the nuclear isoform of the T-cell PTP (TC-PTP).TC45 can dephosphorylate Stat1 both in vitro and in vivo.Nuclear extracts lacking TC45 fail to dephosphorylate Stat1.Furthermore, the dephosphorylation of IFN-induced tyrosine-phosphorylated Stat1 is defective in TC-PTP-null mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary thymocytes.Reconstitution of TC-PTP-null MEFs with TC45, but not the endoplasmic reticulum (ER)-associated isoform TC48, rescues the defect in Stat1 dephosphorylation.The dephosphorylation of Stat3, but not Stat5 or Stat6, is also affected in TC-PTP-null cells.Our results identify TC45 as a PTP responsible for the dephosphorylation of Stat1 in the nucleus.

The reversible tyrosine phosphorylation of proteins, modulated by the coordinated actions of protein-tyrosine kinases and protein-tyrosine phosphatases (PTPs), regulates the cellular response to a wide variety of stimuli. It is established that protein kinases possess discrete sets of substrates and that substrate recognition is often dictated by the presence of consensus phosphorylation sites. Here, we have extended this concept to the PTPs and demonstrated that (E/D)-pY-pY-(R/K) is a consensus substrate recognition motif for PTP1B. We have shown that JAK2 and TYK2 are substrates of PTP1B and that the substrate recognition site within theses kinases is similar to the site of dephosphorylation previously identified within the insulin receptor. A substrate-trapping mutant of PTP1B formed a stable interaction with JAK2 and TYK2 in response to interferon stimulation. Expression of wild type or substrate-trapping mutant PTP1B inhibited interferon-dependent transcriptional activation. Finally, mouse embryo fibroblasts deficient in PTP1B displayed subtle changes in tyrosine phosphorylation, including hyperphosphorylation of JAK2. The closely related JAK family member, JAK1, which does not match the consensus dephosphorylation site, was not recognized as a substrate. These data illustrate that PTP1B may be an important physiological regulator of cytokine signaling and that it may be possible to derive consensus substrate recognition motifs for other members of the PTP family, which may then be used to predict novel physiological substrates. The reversible tyrosine phosphorylation of proteins, modulated by the coordinated actions of protein-tyrosine kinases and protein-tyrosine phosphatases (PTPs), regulates the cellular response to a wide variety of stimuli. It is established that protein kinases possess discrete sets of substrates and that substrate recognition is often dictated by the presence of consensus phosphorylation sites. Here, we have extended this concept to the PTPs and demonstrated that (E/D)-pY-pY-(R/K) is a consensus substrate recognition motif for PTP1B. We have shown that JAK2 and TYK2 are substrates of PTP1B and that the substrate recognition site within theses kinases is similar to the site of dephosphorylation previously identified within the insulin receptor. A substrate-trapping mutant of PTP1B formed a stable interaction with JAK2 and TYK2 in response to interferon stimulation. Expression of wild type or substrate-trapping mutant PTP1B inhibited interferon-dependent transcriptional activation. Finally, mouse embryo fibroblasts deficient in PTP1B displayed subtle changes in tyrosine phosphorylation, including hyperphosphorylation of JAK2. The closely related JAK family member, JAK1, which does not match the consensus dephosphorylation site, was not recognized as a substrate. These data illustrate that PTP1B may be an important physiological regulator of cytokine signaling and that it may be possible to derive consensus substrate recognition motifs for other members of the PTP family, which may then be used to predict novel physiological substrates. protein-tyrosine kinase protein-tyrosine phosphatase insulin receptor interferon mouse embryo fibroblast The major regulatory mechanism that underlies cellular responses to external stimuli is reversible protein phosphorylation. For example, most growth factors and certain hormones exert their effects through the activation of protein-tyrosine kinases (PTKs).1 Furthermore, members of the protein-tyrosine phosphatase (PTP) family cooperate with PTKs to fine-tune the responses to extracellular stimuli. In fact, PTPs act not only to attenuate PTK-dependent signaling, but also in cooperation with PTKs to promote signaling (1Neel B.G. Tonks N.K. Curr. Opin. Cell Biol. 1997; 9: 193-204Crossref PubMed Scopus (736) Google Scholar). The identification of new PTPs has occurred at a rapid rate, with one of the remaining challenges being to identify their physiological substrates. Before their initial characterization and identification, it was expected that there would be a small number of highly active, widely expressed PTPs, which would exhibit broad substrate specificity. In contrast, it has become clear that the PTP family is large and diverse, and that the enzymes may exhibit exquisite substrate specificityin vivo (2Flint A.J. Tiganis T. Barford D. Tonks N.K. Proc. Natl. Acad. of Sci. U. S. A. 1997; 94: 1680-1685Crossref PubMed Scopus (680) Google Scholar, 3Garton A.J. Flint A.J. Tonks N.K. Mol. Cell. Biol. 1996; 16: 6408-6418Crossref PubMed Scopus (232) Google Scholar, 4Tonks N.K. Neel B.G. Curr. Opin. Cell Biol. 2001; 13: 182-195Crossref PubMed Scopus (463) Google Scholar). Members of the PTP family are defined by the presence of a conserved signature motif, (I/V)HCXX GXX R(S/T) that is located within a structurally conserved catalytic domain of 280 residues (5Barford D. Curr. Opin. Struct. Biol. 1995; 5: 728-734Crossref PubMed Scopus (86) Google Scholar, 6Andersen J.N. Mortensen O.H. Peters G.H. Drake P.G. Iversen L.F. Olsen O.H. Jansen P.G. Andersen H.S. Tonks N.K. Moller N.P.H. Mol. Cell. Biol. 2001; (in press)PubMed Google Scholar). The structural diversity within the PTP family largely arises from the nature of domains that are attached to the catalytic core. These include the extracellular ligand binding segments of receptor PTPs, containing immunoglobulin and fibronectin type III domains, as well as PDZ, SH2, lipid binding, and membrane-targeting domains in intracellular PTPs that serve both targeting and regulatory functions (5Barford D. Curr. Opin. Struct. Biol. 1995; 5: 728-734Crossref PubMed Scopus (86) Google Scholar, 6Andersen J.N. Mortensen O.H. Peters G.H. Drake P.G. Iversen L.F. Olsen O.H. Jansen P.G. Andersen H.S. Tonks N.K. Moller N.P.H. Mol. Cell. Biol. 2001; (in press)PubMed Google Scholar). It has been suggested that the substrate specificity of certain PTPs is determined by these targeting domains, which act to deliver the enzymes to specific subcellular locations or signaling complexes. In fact they have been described as “zip codes” that “address” the PTPs to defined subcellular compartments (7Mauro L.J. Dixon J.E. Trends Biochem. 1994; 19: 151-155Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (180) Google Scholar). For example, PTP1B is targeted to the endoplasmic reticulum (8Frangioni J.V. Beahm P.H. Shifrin V. Jost C.A. Neel B.G. Cell. 1992; 68: 545-560Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (504) Google Scholar), whereas the spliced variants of its closest relative TCPTP display differential localization, being targeted to either the endoplasmic reticulum or the nucleus (9Lorenzen J.A. Dadabay C.Y. Fischer E.H. J. Cell Biol. 1995; 131: 631-643Crossref PubMed Scopus (116) Google Scholar). Although there are several such examples, this targeting concept does not take into account intrinsic specificity within individual catalytic domains. In the case of SHP1 and SHP2, the tandem SH2 domains attached to the conserved catalytic core (10Neel B.G. Semin. Cell Biol. 2001; 4: 419-432Crossref Scopus (106) Google Scholar) recognize different phosphopeptide motifs and direct the enzymes to distinct targets within the cell (11Songyang Z. Shoelson S.E. Chaudhuri M. Gish G. Pawson T. Haser W.G. King F. Roberts T. Ratnofsky S. Lechleider R.J. Cell. 1993; 72: 767-778Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (2381) Google Scholar). However, the catalytic domains of these enzymes are not interchangeable, as illustrated by the fact that the catalytic domain of SHP-1 is unable to substitute for that of SHP-2 in mediating the effects of the latter on fibroblast growth factor-inducedXenopus mesoderm induction (12O'Reilly A.M. Neel B.G. Mol. Cell. Biol. 1998; 18: 161-177Crossref PubMed Scopus (100) Google Scholar). Such observations illustrate that both catalytic and noncatalytic domains contribute to substrate specificity of PTPs in vivo. Previously, by integrating crystallographic, kinetic, and peptide binding studies, we defined the molecular basis for dephosphorylation of the activation loop of the insulin receptor (IR) by PTP1B (13Salmeen A. Andersen J.N. Myers M.P. Tonks N.K. Barford D. Mol. Cell. 2000; 6: 1401-1412Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (397) Google Scholar). It was shown that there are extensive interactions between the catalytic domain of PTP1B and the tandem Tyr(P) motif of the IR, such that the substrate Tyr(P) residue is selected at the catalytic site, and the second Tyr(P) residue is engaged in an adjacent Tyr(P) recognition pocket. Furthermore, an acidic and a basic residue, which flank the tandem Tyr(P) motif on the N- and C-terminal side, respectively, form unique interactions with the surface of PTP1B, contributing to the observed high affinity of PTP1B for tandem Tyr(P)-containing peptides relative to their monophosphorylated counterparts (13Salmeen A. Andersen J.N. Myers M.P. Tonks N.K. Barford D. Mol. Cell. 2000; 6: 1401-1412Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (397) Google Scholar). The presence of a second aryl phosphate binding site in PTP1B has also been reported by others (14Puius Y.A. Zhao Y. Sullivan M. Lawrence D.S. Almo S.C. Zhang Z. Proc. Natl. Acd. Sci. U. S. A. 1997; 94: 13420-13425Crossref PubMed Scopus (400) Google Scholar), and it has been shown that short peptides containing vicinal nonhydrolyzable analogs of Tyr(P) are potent inhibitors of PTP1B (15Desmarais S. Friesen R.W. Zamboni R. Ramachandran C. Biochem. J. 1999; 337: 219-223Crossref PubMed Scopus (56) Google Scholar). With the exception of the closely related TCPTP, other PTPs do not appear to possess this second Tyr(P) recognition site, suggesting that PTP1B and TCPTP are likely to recognize tandem Tyr(P) residues. Interestingly, it was shown previously that TCPTP preferentially recognizes the adaptor protein Shc as a substrate when it is phosphorylated on the tandem Tyr(P) residues 239 and 240 (16Tiganis T. Bennett A.M. Ravichandran K.S. Tonks N.K. Mol. Cell. Biol. 1998; 18: 1622-1634Crossref PubMed Google Scholar). It has been established that assembly of the components of signal transduction pathways and propagation of the signal in response to a particular stimulus requires sequence-specific protein-protein recognition. For example, this occurs not only at the level of substrate phosphorylation by protein kinases (17Kemp B.E. Pearson R.B. Trends Biochem. Sci. 1990; 15: 342-346Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (805) Google Scholar), but also in protein-protein interactions directed by signaling modules such as SH2 domains (18Pawson T. Scott J.D. Science. 1997; 278: 2075-2080Crossref PubMed Scopus (1896) Google Scholar). In this current study, we have investigated whether the motif (E/D)-pY-pY-(R/K), which was identified previously as being important for the interaction of PTP1B with the activation segment of the IR (13Salmeen A. Andersen J.N. Myers M.P. Tonks N.K. Barford D. Mol. Cell. 2000; 6: 1401-1412Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (397) Google Scholar), could be used to predict further novel physiological substrates for PTP1B. Upon searching sequence data bases we noted the presence of this motif in the PTKs TYK2 and JAK2, which are essential mediators of cytokine signaling that are required to activate the STAT family of transcription factors (19Darnell Jr., J.E. J. Interferon Cytokine Res. 1998; 18: 549-554Crossref PubMed Scopus (145) Google Scholar, 20Ihle J.N. Adv. Immunol. 1995; 60: 1-35Crossref PubMed Google Scholar). In this study, we have examined the interaction of substrate-trapping PTP1B mutants with these PTKs, tested the effects of PTP1B on STAT-dependent reporters, and looked at the status of tyrosine phosphorylation in PTP1B-deficient fibroblasts. Our data revealed that TYK2 and JAK2 arebona fide substrates of PTP1B and demonstrate that PTP1B plays a role in the negative regulation of cytokine signaling. Importantly this study illustrates that it may be possible to derive consensus substrate recognition motifs for members of the PTP family, which can be used to predict novel substrates and provide insights into physiological function. All cell lines were maintained in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with 10% fetal calf serum and antibiotics. HEK293 cells were transfected via calcium phosphate co-precipitation with 20 μg of DNA/10-cm dish. The calcium phosphate/DNA co-precipitate was removed 16 h after addition, and the cells were returned to growth medium for 36 h before harvesting. Transfection efficiency was determined by inclusion of a GFP expression plasmid (1 μg) in all transfections. Cell lysate, immunobloting, and substrate trapping experiments were performed as described in Ref. 2Flint A.J. Tiganis T. Barford D. Tonks N.K. Proc. Natl. Acad. of Sci. U. S. A. 1997; 94: 1680-1685Crossref PubMed Scopus (680) Google Scholar. Protein levels were determined by the method of Bradford, using bovine serum albumin as a standard, and equal protein was loaded in each lane. TYK2 antibodies were obtained from Cell Signaling Technology. JAK1 and JAK2 antibodies were obtained from Upstate Biotechnology. The phospho-specific antibodies (Tyr(P)-TYK21054/1055 and Tyr(P)-JAK21007/1008) were from BIOSOURCE International (Camarillo, CA), and the phosphospecific STAT antibodies (Tyr(P)701-STAT1 and Tyr(P)705-STAT3) were from Cell Signaling Technology. For luciferase reporter gene assays, cells were transfected with a β−galactosidase expression plasmid (CMV-βgal), as a control for transfection efficiency, the reporter gene, and either empty vector or cDNA expression plasmids for PTP1B, as indicated. The reporter constructs contained a TATA box and the firefly luciferase open reading frame downstream of three copies of the GAS element of the murine Ly6E gene, for interferon-γ (IFN-γ) responses (21Wen Z. Zhong Z. Darnell Jr., J.E. Cell. 1995; 82: 241-250Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1742) Google Scholar), or five copies of the ISRE element of the human ISG-54 gene, for interferon-α (IFN-α) responses (22Parisien J.P. Lau J.F. Rodriguez J.J. Sullivan B.M. Moscona A. Parks G.D. Lamb R.A. Horvath C.M. Virology. 2001; 283: 230-239Crossref PubMed Scopus (195) Google Scholar). After 12 h, the transfection medium was replaced with fresh medium with or without IFN (1000 units/ml IFN-γ, 5 ng/ml IFN-α). Cells were harvested 12 h later in lysis buffer and luciferase activity measured according to the manufacturer’s protocol (Promega). Values for luciferase activity were normalized to β-galactosidase activity. Previous work indicated that PTP1B preferentially recognizes peptide substrates containing the sequence motif (E/D)-pY-pY-(R/K) (13Salmeen A. Andersen J.N. Myers M.P. Tonks N.K. Barford D. Mol. Cell. 2000; 6: 1401-1412Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (397) Google Scholar). Therefore, we tested whether this motif could be used to predict candidate physiological protein substrates for PTP1B. We first identified all proteins in the SwissProt data base that contained two adjacent tyrosine residues flanked by acidic and basic amino acids, using the PATTINPROT algorithm at the Network Protein Sequence Analysis website (23Combet C. Blanchet C. Geourjon C. Deleage G. Trends Biochem. 2000; 25: 147-150Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1432) Google Scholar). Because the subset of tyrosine-phosphorylated proteins in the proteome has not yet been annotated, this search retrieved more than 800 proteins, many of which are unlikely to be tyrosine-phosphorylated in vivo. However, members of the PTK family were identified in this search, with enzymes from 7 out of 22 PTK subfamilies (24Hanks S.K. Quinn A.M. Methods Enzymol. 1991; 200: 38-62Crossref PubMed Scopus (1080) Google Scholar) being represented. The specified motif is found in the activation loop of these PTKs and phosphorylation of the tyrosine residues is required for kinase activation (25Hanks S.K. Hunter T. FASEB J. 1995; 9: 576-596Crossref PubMed Scopus (2281) Google Scholar, 26Bossemeyer D. FEBS Lett. 1995; 369: 57-61Crossref PubMed Scopus (90) Google Scholar). Therefore, as these phosphoproteins would be excellent candidate substrates for PTP1B, we focused our analysis on the JAK/TYK2 subfamily, in which JAK2 (E-Y-Y-R) and TYK2 (E-Y-Y-K) represent perfect matches with the motif, but JAK1 (E-Y-Y-T) does not meet the consensus (Fig. 1 A). In response to IFN-α, receptor dimerization leads to the activation of JAK1 and TYK2 by cross-phosphorylation, whereas in response to IFN-γ, JAK1 and JAK2 are phosphorylated and activated (27Beadling C. Guschin D. Witthuhn B.A. Ziemiecki A. Ihle J.N. Kerr I.M. Cantrell D.A. EMBO J. 1994; 13: 5605-5615Crossref PubMed Scopus (194) Google Scholar, 28Ihle J.N. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1994; 206: 268-272Crossref PubMed Scopus (67) Google Scholar). In each case, activation of both PTKs is required for downstream signaling (20Ihle J.N. Adv. Immunol. 1995; 60: 1-35Crossref PubMed Google Scholar, 30Leaman D.W. Leung S. Li X. Stark G.R. FASEB J. 1996; 10: 1578-1588Crossref PubMed Scopus (271) Google Scholar, 31Stark G.R. Harvey Lect. 1997; 93: 1-16PubMed Google Scholar). Since JAK1 and either JAK2 or TYK2 are activated at the same time and place, these signaling responses to interferon provide an opportunity to examine the intrinsic substrate specificity of PTP1B and to test our prediction that PTP1B displays selectivity for protein substrates containing the (E/D)-pY-pY-(R/K) motif. As a first step, we performed substrate trapping experiments in HEK293 cells. Wild type or D181A substrate-trapping mutant (PTP1B-DA) (2Flint A.J. Tiganis T. Barford D. Tonks N.K. Proc. Natl. Acad. of Sci. U. S. A. 1997; 94: 1680-1685Crossref PubMed Scopus (680) Google Scholar) forms of PTP1B were transiently expressed in HEK293 cells. Following a 15-min stimulation with IFN-α or IFN-γ, PTP1B was immunoprecipitated, and the resulting complex was resolved by SDS-PAGE and analyzed by immunoblotting (Fig. 1, B and C). We observed that in response to IFN-α, both JAK1 and TYK2 were phosphorylated on tyrosyl residues. However, we were only able to detect an interaction between the substrate trapping mutant form of PTP1B and endogenous TYK2 (Fig. 1 B), but not with JAK1 (Fig. 1 C). Similarly, we observed that in response to IFN-γ, both JAK1 and JAK2 were phosphorylated, and endogenous JAK2 was recovered in a complex with PTP1B-DA (Fig. 1 B). However, no complex formation with JAK1 was detected (Fig. 1 C). It is important to note that the interaction between the JAK family members and the PTP1B-trapping mutant was ligand-dependent, indicating that the interaction is dependent upon the activation and tyrosine phosphorylation of TYK2 and JAK2 (Fig. 1 B). Furthermore, we did not observe these interactions when either wild type PTP1B (Fig. 1, B and C) or a His-tagged mutant form of TYK2 (TYK2-Y1054/1055F), which lacks the tandem phosphorylation sites within the consensus motif, were co-expressed with the PTP1B-DA-trapping mutant (data not shown). These observations suggest that PTP1B recognized TYK2 and JAK2 as substrates in this context. However, although JAK1 was activated and tyrosine-phosphorylated in this system (data not shown), no interaction with PTP1B was detected (Fig. 1 C), indicating selectivity of PTP1B toward TYK2 and JAK2, the two family members that match the proposed consensus substrate recognition motif. Specificity in the interaction was further emphasized by the fact that upon immunoblotting of substrate-trapping mutant-containing complexes with anti-Tyr(P) antibody, we did not detect interactions between PTP1B and other phosphorylated proteins in response to interferon (data not shown). In addition we did not observe interactions between JAKs and either wild type or substrate-trapping mutant forms of a distinct PTP, PTP-MEG2 (Fig. 1, B and C). To examine whether PTP1B had the capacity to modulate interferon-dependent signaling, we tested the effects of overexpression of wild type or substrate-trapping mutant forms of the enzyme on two reporters of interferon-dependent transcription (21Wen Z. Zhong Z. Darnell Jr., J.E. Cell. 1995; 82: 241-250Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1742) Google Scholar, 22Parisien J.P. Lau J.F. Rodriguez J.J. Sullivan B.M. Moscona A. Parks G.D. Lamb R.A. Horvath C.M. Virology. 2001; 283: 230-239Crossref PubMed Scopus (195) Google Scholar) (Fig. 2). We observed that PTP1B suppressed interferon-induced reporter activity. Importantly, we observed the inhibitory effects of PTP1B on interferon-dependent transcriptional responses not only with the wild type enzyme, but also with substrate-trapping mutant forms. This is consistent with the observation that the substrate-trapping mutant of PTP1B forms a stable complex with JAK2 and TYK2 (Fig. 1). Interaction between the PTP and the phosphorylation sites on the activation loop of the PTK would be expected to inhibit kinase activity by restricting access of substrates to the active site. In independent experiments, we did not detect an interaction between the trapping mutant of PTP1B and either STAT3 or STAT1 (data not shown), illustrating that the inhibitory effects of PTP1B on interferon signaling were not mediated through direct interactions between the PTP and STAT family members. Furthermore, these data indicate that the interaction between PTP1B and specific members of the JAK family occurs in a cellular context. These data support the concept that PTP1B displays restricted intrinsic substrate specificity. In contrast, if PTP1B were to exhibit broad substrate specificity in vivo, then it would be anticipated that ablation of its expression by gene disruption would result in global changes in the number of tyrosine-phosphorylated proteins. Therefore, we compared the extent of tyrosine phosphorylation in PTP1B+/+ and PTP1B−/− mouse embryo fibroblasts (MEFs) (32Cheng A. Bal G.S. Kennedy B.P. Tremblay M.L. J. Biol. Chem. 2001; 276: 25848-25855Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (97) Google Scholar) under basal conditions and following stimulation by insulin, IFN-α and IFN-γ. Strikingly, we observed that the overall profile of tyrosine phosphorylated proteins was remarkably similar in the two cell lines (Fig. 3 A). The only major difference observed was a decrease in phosphorylation of a protein of ∼130 kDa in the PTP1B−/− cells, which is consistent with the finding that genetic disruption of PTP1B results in a decrease in integrin-dependent signaling (32Cheng A. Bal G.S. Kennedy B.P. Tremblay M.L. J. Biol. Chem. 2001; 276: 25848-25855Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (97) Google Scholar). In addition, we observed that insulin-induced tyrosine phosphorylation was potentiated in PTP1B−/− MEFs compared with their PTP1B+/+ counterparts (Fig.3 A), consistent with the identification of PTP1B as one of the primary PTPs that regulates the phosphorylation status of the insulin receptor (33Elchebly M. Payette P. Michaliszyn E. Cromlish W. Collins S. Loy A.L. Normandin D. Cheng A. Himms-Hagen J. Chan C.C. Ramachandran C. Gresser M.J. Tremblay M.L. Kennedy B.P. Science. 1999; 283: 1544-1548Crossref PubMed Scopus (1906) Google Scholar, 34Klaman L.D. Boss O. Peroni O.D. Kim J.K. Martino J.L. Zabolotny J.M. Moghal N. Lubkin M. Kim Y.B. Sharpe A.H. Stricker-Krongrad A. Shulman G.I. Neel B.G. Kahn B.B. Mol. Cell. Biol. 2000; 20: 5479-5899Crossref PubMed Scopus (1124) Google Scholar). Furthermore, using a phospho-specific antibody to the activation loop of JAK2, we observed that the PTP1B consensus recognition motif within JAK2 was hyperphosphorylated in the PTP1B-deficient cells relative to PTP1B+/+ controls (Fig.3 B). To study the significance of increased JAK2 phosphorylation on downstream signaling, we examined the activation status of two effectors of interferon signaling, STAT1 and STAT3, for which phospho-specific antibodies are commercially available. The STAT3 blots (Fig. 3 C, top panel) revealed increased interferon signaling in PTP1B−/− cells relative to PTP1B+/+ controls, in each condition tested. Furthermore, following IFN-α stimulation we observed enhanced phosphorylation of STAT1 in PTP1B-deficient MEFs compared with the wild type controls. However, this difference in STAT1 phosphorylation was not apparent following IFN-γ treatment, consistent with phosphorylation of this transcription factor primarily by JAK1 or another kinase that is not a direct target of PTP1B. These data, which are consistent with those obtained using substrate trapping mutant forms of the phosphatase (Fig. 1), further emphasize that PTP1B exhibits restricted substrate specificity in vivo. Although one aspect of this specificity may arise from the restricted subcellular localization of PTP1B in the endoplasmic reticulum (8Frangioni J.V. Beahm P.H. Shifrin V. Jost C.A. Neel B.G. Cell. 1992; 68: 545-560Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (504) Google Scholar), our data are also consistent with specificity intrinsic to the catalytic domain. The latter aspect of specificity is now understood in structural terms as arising from the presence of two Tyr(P)-binding pockets, the active site and a second, noncatalytic Tyr(P)-binding site, that is connected to the active site by a short channel (13Salmeen A. Andersen J.N. Myers M.P. Tonks N.K. Barford D. Mol. Cell. 2000; 6: 1401-1412Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (397) Google Scholar). In most other PTPs, including PTP-MEG2, access to the second Tyr(P)-binding site is occluded due to the presence of bulky hydrophobic residues at the position equivalent to Gly259in PTP1B (35Peters G.H. Iversen L.F. Branner S. Andersen H.S. Mortensen S.B. Olsen O.H. Moller K.B. Moller N.P.H. J. Biol. Chem. 2000; 275: 18201-18209Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (56) Google Scholar). Based on amino acid sequence alignments of PTP catalytic domains, only TCPTP is predicted also to have this second Tyr(P)-binding site (5Barford D. Curr. Opin. Struct. Biol. 1995; 5: 728-734Crossref PubMed Scopus (86) Google Scholar). The present study also highlights the importance of the acidic and basic residues, which flank the vicinal Tyr(P) residues and interact with surface features that are unique to PTP1B, in substrate recognition (13Salmeen A. Andersen J.N. Myers M.P. Tonks N.K. Barford D. Mol. Cell. 2000; 6: 1401-1412Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (397) Google Scholar). Although this motif is important for optimal substrate recognition, its presence is not essential for dephosphorylation of a protein by PTP1B. Interestingly, there are reports that PTP1B can accommodate substrates that do not posses tandem Tyr(P) residues (2Flint A.J. Tiganis T. Barford D. Tonks N.K. Proc. Natl. Acad. of Sci. U. S. A. 1997; 94: 1680-1685Crossref PubMed Scopus (680) Google Scholar). It is possible that even in these cases the second Tyr(P)-binding site may still be engaged, with a water molecule forming a bridge between the substrate and Arg24 in the second Tyr(P)-binding pocket (36Jia Z.C. Barford D. Flint A.J. Tonks N.K. Science. 1995; 268: 1754-1758Crossref PubMed Scopus (554) Google Scholar). Two important conclusions can be drawn from this study. First, using the structure of a complex between PTP1B and a phosphorylated peptide derived from the activation loop of the IR, we noted previously that the presence of vicinal Tyr(P) residues in a potential substrate enhanced the affinity of its interaction with PTP1B. Furthermore, we had identified the sequence (D/E)-pY-pY-(R/K) as a potential consensus substrate recognition motif (13Salmeen A. Andersen J.N. Myers M.P. Tonks N.K. Barford D. Mol. Cell. 2000; 6: 1401-1412Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (397) Google Scholar). This current study illustrates that this sequence motif can be used successfully to identify additional physiological protein substrates for PTP1B. Although this motif may represent a minimal recognition sequence, it is possible that additional contacts between PTP1B and its substrates may contribute to affinity and specificity. Such additional determinants of substrate recognition remain to be clarified. Nevertheless, the definition of consensus phosphorylation sites has proven to be an important tool in signal transduction research for the identification of substrates for protein kinases. This study demonstrates for the first time that this concept may also be applicable to protein phosphatases, such as PTP1B, and that consensus recognition sites may also exist for other PTPs. Perhaps it may be possible in the future to use this approach to expand the repertoire of physiological substrates of other members of the PTP family of enzymes. Second, we have identified PTP1B as a potential regulator of cytokine-dependent signaling. There has been another report indicating that PTP1B may exert an inhibitory effect on JAK-STAT signaling; however, in that case it was suggested that the primary target of PTP1B was STAT-5 (37Aoki N. Matsuda T. J. Biol. Chem. 2000; 275: 39718-39726Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (154) Google Scholar). The reason for the discrepancy between that report and our current study remains to be ascertained. Nevertheless, when one considers that the major site of regulatory STAT dephosphorylation is believed to be in the nucleus (38Haspel R.L. Darnell Jr., J.E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 10188-10193Crossref PubMed Scopus (166) Google Scholar), and PTP1B is known to be cytoplasmic (8Frangioni J.V. Beahm P.H. Shifrin V. Jost C.A. Neel B.G. Cell. 1992; 68: 545-560Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (504) Google Scholar), its contribution to the physiological regulation of STAT dephosphorylation will require further clarification. Furthermore, the process of STAT dephosphorylation remains poorly understood and, again in contrast to (37Aoki N. Matsuda T. J. Biol. Chem. 2000; 275: 39718-39726Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (154) Google Scholar), other PTPs such as SHP-2 (29Yu C.L. Jin Y.J. Burakoff S.J. J. Biol. Chem. 2000; 275: 599-604Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (134) Google Scholar) have also been implicated in the process. In this study, we have shown that PTP1B recognizes TYK2 and JAK2, but not JAK1, and can modulate signaling responses to IFN-α and IFN-γ. One of the striking aspects of the phenotype of PTP1B-deficient mice is their resistance to weight gain when fed a high fat diet (33Elchebly M. Payette P. Michaliszyn E. Cromlish W. Collins S. Loy A.L. Normandin D. Cheng A. Himms-Hagen J. Chan C.C. Ramachandran C. Gresser M.J. Tremblay M.L. Kennedy B.P. Science. 1999; 283: 1544-1548Crossref PubMed Scopus (1906) Google Scholar, 34Klaman L.D. Boss O. Peroni O.D. Kim J.K. Martino J.L. Zabolotny J.M. Moghal N. Lubkin M. Kim Y.B. Sharpe A.H. Stricker-Krongrad A. Shulman G.I. Neel B.G. Kahn B.B. Mol. Cell. Biol. 2000; 20: 5479-5899Crossref PubMed Scopus (1124) Google Scholar). Some of these effects may arise from defects in signaling in response to the satiety hormone leptin in the hypothalamus of PTP1B-deficient mice. Our data, demonstrating recognition of JAK2 and TYK2 as substrates by PTP1B, suggest that the PTP may normally function as a negative regulator of leptin signaling in the brain. Thus it is possible that dysfunctional regulation of members of the JAK subfamily of PTKs may contribute to the resistance to weight gain displayed by PTP1B-deficient mice.

Background Flavaglines are a family of natural products from the genus Aglaia that exhibit anti-cancer activity in vitro and in vivo and inhibit translation initiation. They have been shown to modulate the activity of eIF4A, the DEAD-box RNA helicase subunit of the eukaryotic initiation factor (eIF) 4F complex, a complex that stimulates ribosome recruitment during translation initiation. One flavagline, silvestrol, is capable of modulating chemosensitivity in a mechanism-based mouse model. Methodology/Principal Findings Among a number of flavagline family members tested herein, we find that silvestrol is the more potent translation inhibitor among these. We find that silvestrol impairs the ribosome recruitment step of translation initiation by affecting the composition of the eukaryotic initiation factor (eIF) 4F complex. We show that silvestrol exhibits significant anticancer activity in human breast and prostate cancer xenograft models, and that this is associated with increased apoptosis, decreased proliferation, and inhibition of angiogenesis. We demonstrate that targeting translation by silvestrol results in preferential inhibition of weakly initiating mRNAs. Conclusions/Significance Our results indicate that silvestrol is a potent anti-cancer compound in vivo that exerts its activity by affecting survival pathways as well as angiogenesis. We propose that silvestrol mediates its effects by preferentially inhibiting translation of malignancy-related mRNAs. Silvestrol appears to be well tolerated in animals.

ABSTRACT Cyclin M (CNNM1-4) proteins maintain cellular and body magnesium (Mg 2+ ) homeostasis. Using various biochemical approaches, we have identified members of the CNNM family as direct interacting partners of ADP-ribosylation factor-like protein 15 (ARL15), a small GTP-binding protein. ARL15 interacts with CNNMs at their carboxyl-terminal conserved cystathionine-β-synthase (CBS) domains. In silico modeling of the interaction using the reported structures of both CNNM2 and ARL15 supports that the small GTPase specifically binds the CBS1 domain. Immunocytochemical experiments demonstrate that CNNM2 and ARL15 co-localize in the kidney, with both proteins showing subcellular localization in the Golgi-apparatus. Most importantly, we found that ARL15 is required for forming complex N-glycosylation of CNNMs. Overexpression of ARL15 promotes complex N-glycosylation of CNNM3. Mg 2+ uptake experiments with a stable isotope demonstrate that there is a significant increase of 25 Mg 2+ uptake upon knockdown of ARL15 in multiple kidney cancer cell lines. Altogether, our results establish ARL15 as a novel negative regulator of Mg 2+ transport by promoting the complex N-glycosylation of CNNMs.

Abstract Increased understanding of the modulatory pathways controlling CD8 T cell responses has led to the formulation of successful checkpoint inhibitor-based immunotherapies against cancer. However, their effectiveness is limited to a few tumor types, motivating the search for novel combinatorial strategies. PTPN1 and PTPN2 are two homologous protein tyrosine phosphatases recently proposed as potent intracellular checkpoints. Furthermore, their catalytic domain is a propitious target for small-molecule pharmacological intervention. Herein we investigated the potential effects of conditional genetic deletion of either or both phosphatases in mouse CD8 T cells, one of the main effectors in cancer immunotherapy. Our results demonstrated that hemizygous deletion of PTPN1 in a PTPN2 deficient background heightens the enhanced effector phenotype already observed in PTPN2 defective CD8 T cells. This functional gain is mediated by an autocrine IL-10 positive feedback loop. Pharmacological inhibition with a PTPN1/2 small-molecule inhibitor yielded similar results, highlighting the importance of simultaneously inhibiting both phosphatases. Our study uncovers a novel mechanism by which the downregulation of PTPN1 and PTPN2 act as a powerful tool for potentiating CD8 cytotoxic responses.