ABSTRACT Several mechanistic (thermodynamic) models have been developed for the folding of SAM-II riboswitch as a function of SAM and magnesium concentrations. For each model, the model parameters (equilibrium constants) have been determined from experimental (apparent) binding data, based on the underlying assumptions of the model. The predicted titration curves computed from the different models were calculated and compared with actual experimental observation of the fraction of the RNA forming a pseudoknot at specific concentration of the ligands. Strikingly, only one of the six models correctly predicts the experimental findings, confirming the dominant mechanism of the riboswitch function. More interestingly, the latter mechanism is found to be the most efficient compared to the other possible mechanisms. The study sheds light on the cognate ligand conformational capture mechanism of the SAM-II riboswitch in the presence of specific concentrations of magnesium ions. The presented mathematical and thermodynamic framework, as well as the inferred equilibrium constants, provide foundations for making accurate quantitative prediction of the SAM-II riboswitch ensemble populations as a function of SAM and magnesium concentrations. The mechanistic linked equilibria model can be generalized to describe other thermodynamically driven riboswitches and hence facilitate identifying RNA intermediates that can be leveraged for small molecule drug design.

The realization that non protein-coding RNA (ncRNA) is implicated in an increasing number of cellular processes, many related to human disease, makes it imperative to understand and predict RNA folding. RNA secondary structure prediction is more tractable than tertiary structure or protein structure. Yet insights into RNA structure-function relationships are complicated by coupling between RNA folding and ligand binding. Here, we introduce a simple statistical mechanical formalism to calculate perturbations to equilibrium secondary structure conformational distributions for RNA, in the presence of bound cognate ligands. For the first time, this formalism incorporates a key factor in coupling ligand binding to RNA conformation: the differential affinity of the ligand for a range of RNA-folding intermediates. We apply the approach to the SAM-I riboswitch, for which binding data is available for analogs of intermediate secondary structure conformers. Calculations of equilibrium secondary structure distributions during the transcriptional "decision window" predict subtle shifts due to the ligand, rather than an on/off switch. The results suggest how ligand perturbation can release a kinetic block to the formation of a terminator hairpin in the full-length riboswitch. Such predictions identify aspects of folding that are most affected by ligand binding, and can readily be compared with experiment.

ABSTRACT Riboswitches are regulatory elements present in bacterial messenger RNA acting as sensors of small molecules and consequently playing a vital role in bacterial gene regulation. The SAM-II riboswitch is a class of riboswitches, that recognizes S-adenosyl methionine. It has been previously illustrated that the presence of Mg 2+ ions stabilizes the pre-existing minor state of the riboswitch, which is structurally characterised by having a nucleated pseudoknot, leading to the increase of its probability. In this study, an analytical equilibrium model is developed to describe the impact of Mg 2+ ions concentration on the folding of the SAM-II riboswitch, linking RNA folding and tertiary interactions energetics to ligand binding, and, hence enabling quantitative predictions. The method was used to study the role of the P1 helix sequence in determining the fraction of binding competent conformers of the SAM-II riboswitch, by simulating the Mg 2+ titration curves of various mutants. Graphical abstract