Recent research in the field of nanometer-scale electronics has focused on the operating principles of small-scale devices and schemes to realize useful circuits. In contrast to established “top-down” fabrication techniques, molecular self-assembly is emerging as a “bottom-up” approach for fabricating nanostructured materials. Biological macromolecules, especially proteins, provide many valuable properties, but poor physical stability and poor electrical characteristics have prevented their direct use in electrical circuits. Here we describe the use of self-assembling amyloid protein fibers to construct nanowire elements. Self-assembly of a prion determinant from Saccharomyces cerevisiae , the N-terminal and middle region (NM) of Sup35p, produced 10-nm-wide protein fibers that were stable under a wide variety of harsh physical conditions. Their lengths could be roughly controlled by assembly conditions in the range of 60 nm to several hundred micrometers. A genetically modified NM variant that presents reactive, surface-accessible cysteine residues was used to covalently link NM fibers to colloidal gold particles. These fibers were placed across gold electrodes, and additional metal was deposited by highly specific chemical enhancement of the colloidal gold by reductive deposition of metallic silver and gold from salts. The resulting silver and gold wires were ≈100 nm wide. These biotemplated metal wires demonstrated the conductive properties of a solid metal wire, such as low resistance and ohmic behavior. With such materials it should be possible to harness the extraordinary diversity and specificity of protein functions to nanoscale electrical circuitry.

Hydrogen sulfide (H2S) is a critical gaseous signaling molecule emerging at the center of a rich field of chemical and biological research. As our understanding of the complexity of physiological H2S in signaling pathways evolves, advanced chemical and technological investigative tools are required to make sense of this interconnectivity. Toward this goal, we have developed an azide-functionalized O-methylrhodol fluorophore, MeRho-Az, which exhibits a rapid >1000-fold fluorescence response when treated with H2S, is selective for H2S over other biological analytes, and has a detection limit of 86 nM. Additionally, the MeRho-Az scaffold is less susceptible to photoactivation than other commonly used azide-based systems, increasing its potential application in imaging experiments. To demonstrate the efficacy of this probe for H2S detection, we demonstrate the ability of MeRho-Az to detect differences in H2S levels in C6 cells and those treated with AOAA, a common inhibitor of enzymatic H2S synthesis. Expanding the use of MeRho-Az to complex and heterogeneous biological settings, we used MeRho-Az in combination with light sheet fluorescence microscopy (LSFM) to visualize H2S in the intestinal tract of live zebrafish. This application provides the first demonstration of analyte-responsive 3D imaging with LSFM, highlighting the utility of combining new probes and live imaging methods for investigating chemical signaling in complex multicellular systems.

The gut microbiota is a complex consortium of microorganisms with the ability to influence important aspects of host health and development. Harnessing this "microbial organ" for biomedical applications requires clarifying the degree to which host and bacterial factors act alone or in combination to govern the stability of specific lineages. To address this issue, we combined bacteriological manipulation and light sheet fluorescence microscopy to monitor the dynamics of a defined two-species microbiota within a vertebrate gut. We observed that the interplay between each population and the gut environment produces distinct spatiotemporal patterns. As a consequence, one species dominates while the other experiences sudden drops in abundance that are well fit by a stochastic mathematical model. Modeling revealed that direct bacterial competition could only partially explain the observed phenomena, suggesting that a host factor is also important in shaping the community. We hypothesized the host determinant to be gut motility, and tested this mechanism by measuring colonization in hosts with enteric nervous system dysfunction due to a mutation in the ret locus, which in humans is associated with the intestinal motility disorder known as Hirschsprung disease. In mutant hosts we found reduced gut motility and, confirming our hypothesis, robust coexistence of both bacterial species. This study provides evidence that host-mediated spatial structuring and stochastic perturbation of communities can drive bacterial population dynamics within the gut, and it reveals a new facet of the intestinal host-microbe interface by demonstrating the capacity of the enteric nervous system to influence the microbiota. Ultimately, these findings suggest that therapeutic strategies targeting the intestinal ecosystem should consider the dynamic physical nature of the gut environment.

Abstract Three-dimensional microscopy is increasingly prevalent in biology due to the development of techniques such as multiphoton, spinning disk confocal, and light sheet fluorescence microscopies. These methods enable unprecedented studies of life at the microscale, but bring with them larger and more complex datasets. New image processing techniques are therefore called for to analyze the resulting images in an accurate and efficient manner. Convolutional neural networks are becoming the standard for classification of objects within images due to their accuracy and generalizability compared to traditional techniques. Their application to data derived from 3D imaging, however, is relatively new and has mostly been in areas of magnetic resonance imaging and computer tomography. It remains unclear, for images of discrete cells in variable backgrounds as are commonly encountered in fluorescence microscopy, whether convolutional neural networks provide sufficient performance to warrant their adoption, especially given the challenges of human comprehension of their classification criteria and their requirements of large training datasets. We therefore applied a 3D convolutional neural network to distinguish bacteria and non-bacterial objects in 3D light sheet fluorescence microscopy images of larval zebrafish intestines. We find that the neural network is as accurate as human experts, outperforms random forest and support vector machine classifiers, and generalizes well to a different bacterial species through the use of transfer learning. We also discuss network design considerations, and describe the dependence of accuracy on dataset size and data augmentation. We provide source code, labeled data, and descriptions of our analysis pipeline to facilitate adoption of convolutional neural network analysis for three-dimensional microscopy data. Author summary The abundance of complex, three dimensional image datasets in biology calls for new image processing techniques that are both accurate and fast. Deep learning techniques, in particular convolutional neural networks, have achieved unprecedented accuracies and speeds across a large variety of image classification tasks. However, it is unclear whether or not their use is warranted in noisy, heterogeneous 3D microscopy datasets, especially considering their requirements of large, labeled datasets and their lack of comprehensible features. To asses this, we provide a case study, applying convolutional neural networks as well as feature-based methods to light sheet fluorescence microscopy datasets of bacteria in the intestines of larval zebrafish. We find that the neural network is as accurate as human experts, outperforms the feature-based methods, and generalizes well to a different bacterial species through the use of transfer learning.

Abstract The microbial communities resident in animal intestines are composed of multiple species that together play important roles in host development, health and disease. Due to the complexity of these communities and the difficulty of characterizing them in situ, the determinants of microbial composition remain largely unknown. Further, it is unclear for many multi-species consortia whether their species-level makeup can be predicted based on an understanding of pairwise species interactions, or whether higher-order interactions are needed to explain emergent compositions. To address this, we examine commensal intestinal microbes in larval zebrafish, initially raised germ-free to allow introduction of controlled combinations of bacterial species. Using a dissection and plating assay, we demonstrate the construction of communities of one to five bacterial species and show that the outcomes from the two-species competitions fail to predict species abundances in more complex communities. With multiple species present, inter-bacterial interactions become weaker and more cooperative, suggesting that higher-order interactions in the vertebrate gut may stabilize complex communities.

Abstract The viscosity of lipid membranes sets the timescales of membrane-associated flows and therefore influences the dynamics of a wide range of cellular processes. Techniques to measure membrane viscosity remain sparse, however, and reported measurements to date, even of similar systems, give viscosity values that span orders of magnitude. To address this, we improve a method based on measuring both the rotational and translational diffusion of membrane-anchored microparticles and apply this approach and one based on tracking the motion of phase-separated lipid domains to the same system of phase-separated giant vesicles. We find good agreement between the two methods, with inferred viscosities within a factor of two of each other. Our technique uses ellipsoidal microparticles, and we show that the extraction of physically meaningful viscosity values from their motion requires consideration of their anisotropic shape. The validation of our method on phase-separated membranes makes possible its application to other systems, which we demonstrate by measuring the viscosity of bilayers composed of lipids with different chain lengths ranging from 14 to 20 carbon atoms, revealing a very weak dependence of two-dimensional viscosity on lipid size. The experimental and analysis methods described here should be generally applicable to a variety of membrane systems, both reconstituted and cellular. Statement of Significance The lipid bilayers that underlie cellular membranes are two-dimensional fluids whose viscosity sets timescales of flow. Lipid membrane viscosity remains poorly quantified, with a paucity of methods and considerable disagreement between values reported using different techniques. We describe a method based on measuring the Brownian diffusion of ellipsoidal microparticles which we apply to phase-separated membranes alongside a previously established method for determining membrane viscosity, finding good agreement between the two techniques. We further examine homogenous membranes composed of lipids with different chain lengths, not amenable to phase-separationbased methods, revealing a very weak dependence of viscosity on lipid size. Our approach should be applicable to a wide range of membrane systems, both in vitro and in living cells.

SUMMARY In a healthy gut, microbes are often aggregated with host mucus, yet the molecular basis for this organization and its impact on intestinal health are unclear. Mucus is a viscous physical barrier separating resident microbes from epithelia, but also provides glycan cues that regulate microbial behaviors. Using experimental evolution, we discovered a mucin-sensing pathway in an Aeromonas symbiont of zebrafish, Aer01. In response to the mucin-associated glycan N-acetylglucosamine, a sensor kinase regulates expression of a mucin-binding adhesin we named MbpA. When MbpA is disrupted, Aer01 colonizes to normal levels, but is largely planktonic and elicits increased intestinal inflammation, traits which are reversed by increasing cell surface MpbA. MbpA-like adhesins are common in human-associated bacteria and expression of an Akkermansia muciniphila MbpA-like adhesin in MbpA-deficient Aer01 restored lumenal aggregation and reversed its pro-inflammatory character. Our work demonstrates how resident bacteria use mucin glycans to modulate behaviors congruent with host health.

Abstract Intestinal microbes, whether resident or transient, influence the physiology of their hosts, altering both the chemical and the physical characteristics of the gut. An example of the latter is the human pathogen Vibrio cholerae’s ability to induce strong mechanical contractions, discovered in zebrafish. The underlying mechanism has remained unknown, but the phenomenon requires the actin crosslinking domain (ACD) of Vibrio’s Type VI Secretion System (T6SS), a multicomponent protein syringe that pierces adjacent cells and delivers toxins. By using a zebrafish-native Vibrio and imaging-based assays of host intestinal mechanics and immune responses, we find that macrophages mediate the connection between the T6SS ACD and intestinal activity: ACD-dependent tissue damage activates macrophages and recruits them from their unperturbed positions near enteric neurons lining the midgut, spurring strong gut contractions resembling those resulting from genetic depletion of macrophages. In addition to illuminating host-directed actions of the widespread T6SS protein apparatus, our findings highlight how localized bacteria-induced injury can reshape neuro-immune cellular dynamics to impact whole-organ physiology.