Delivering the virus genome into the host nucleus through the nuclear pore complex (NPC) is pivotal in human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) infection. The mechanism of this process remains mysterious owing to the NPC complexity and the labyrinth of molecular interactions involved. Here we built a suite of NPC mimics-DNA-origami-corralled nucleoporins with programmable arrangements-to model HIV-1 nuclear entry. Using this system, we determined that multiple cytoplasm-facing Nup358 molecules provide avid binding for capsid docking to the NPC. The nucleoplasm-facing Nup153 preferentially attaches to high-curvature regions of the capsid, positioning it for tip-leading NPC insertion. Differential capsid binding strengths of Nup358 and Nup153 constitute an affinity gradient that drives capsid penetration. Nup62 in the NPC central channel forms a barrier that viruses must overcome during nuclear import. Our study thus provides a wealth of mechanistic insight and a transformative toolset for elucidating how viruses like HIV-1 enter the nucleus.

Increasing evidence has suggested that the HIV-1 capsid enters the nucleus in a largely assembled, intact form. However, not much is known about how the cone-shaped capsid interacts with the nucleoporins (NUPs) in the nuclear pore for crossing the nuclear pore complex. Here, we elucidate how NUP153 binds HIV-1 capsid by engaging the assembled capsid protein (CA) lattice. A bipartite motif containing both canonical and noncanonical interaction modules was identified at the C-terminal tail region of NUP153. The canonical cargo-targeting phenylalanine-glycine (FG) motif engaged the CA hexamer. By contrast, a previously unidentified triple-arginine (RRR) motif in NUP153 targeted HIV-1 capsid at the CA tri-hexamer interface in the capsid. HIV-1 infection studies indicated that both FG- and RRR-motifs were important for the nuclear import of HIV-1 cores. Moreover, the presence of NUP153 stabilized tubular CA assemblies in vitro. Our results provide molecular-level mechanistic evidence that NUP153 contributes to the entry of the intact capsid into the nucleus.

Summary The capsid of human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) plays a pivotal role in viral nuclear import, but the mechanism by which the viral core passages the nuclear pore complex (NPC) is poorly understood. Here, we use DNA-origami mimics of the NPC, termed NuPODs (NucleoPorins Organized by DNA), to reveal the mechanistic underpinnings of HIV-1 capsid nuclear entry. We found that trimeric interface formed via three capsid protein hexamers is targeted by a triple-arginine (RRR) motif but not the canonical phenylalanine-glycine (FG) motif of NUP153. As NUP153 is located on the nuclear face of the NPC, this result implies that the assembled capsid must cross the NPC in vivo . This hypothesis is corroborated by our observations of tubular capsid assemblies penetrating through NUP153 NuPODs. NUP153 prefers to bind highly curved capsid assemblies including those found at the tips of viral cores, thereby facilitating capsid insertion into the NPC. Furthermore, a balance of capsid stabilization by NUP153 and deformation by CPSF6, along with other cellular factors, may allow for the intact capsid to pass NPCs of various sizes. The NuPOD system serves as a unique tool for unraveling the previously elusive mechanisms of nuclear import of HIV-1 and other viruses.

Abstract CLASPs are ubiquitous stabilizers of microtubule dynamics but their molecular targets at the microtubule plus-end are not understood. Using DNA origami-based reconstructions we show that clusters of human CLASP2 form a load-bearing bond with terminal GDP-tubulins at the stabilized microtubule tip. This activity relies on the unconventional TOG2 domain of CLASP2, which releases its high-affinity bond with the GDP-dimers upon their conversion into polymerization-competent GTP-tubulin. By tethering dynamic microtubule ends near immobilized CLASP2, we show that the targets for CLASP2 binding at the polymerizing tip arise stochastically, leading to nanoscale disruptions in microtubule tip integrity. The ability of CLASP2 to recognize nucleotide-specific tubulin conformation and stabilize the catastrophe-promoting GDP-tubulins intertwines with the previously underappreciated exchange between GDP and GTP at terminal tubulins, providing a distinct molecular mechanism to suppress microtubule catastrophe without affecting tubulin incorporation.

Over the past decades, atomic force microscopy (AFM) has emerged as an increasingly powerful tool to study the dynamics of biomolecules at nanometre length scales. However, the more stochastic the nature of such biomolecular dynamics, the harder it becomes to distinguish them from AFM measurement noise. Rapid, stochastic dynamics are inherent to biological systems comprising intrinsically disordered proteins. One role of such proteins is in the formation of the transport barrier of the nuclear pore complex (NPC): the selective gateway for macromolecular traffic entering or exiting the nucleus. Here, we use AFM to observe the dynamics of intrinsically disordered proteins from two systems: the transport barrier of native NPCs, and the transport barrier of a mimetic NPC made using a DNA origami scaffold. Analysing data recorded with 50-200 ms temporal resolution, we highlight the importance of drift correction and appropriate baseline measurements in such experiments. In addition, we describe an auto-correlation analysis to quantify time scales of observed dynamics and to assess their veracity - an analysis protocol that lends itself to the quantification of stochastic fluctuations in other biomolecular systems. The results reveal the surprisingly slow rate of stochastic, collective transitions inside mimetic NPCs, highlighting the importance of FG-nup cohesive interactions.

Nucleoporins (nups) in the central channel of nuclear pore complexes (NPCs) form a selective barrier that suppresses the diffusion of most macromolecules while enabling rapid transport of nuclear transport receptors (NTRs) with bound cargos. The complex molecular interactions between nups and NTRs have been thought to underlie the gatekeeping function of the NPC. Recent studies have shown considerable variation in NPC diameter but how altering NPC diameter might impact the selective barrier properties remains unclear. Here, we build DNA nanopores with programmable diameters and nup arrangement to mimic NPCs of different diameters. We use hepatitis B virus (HBV) capsids as a model for large-size cargos. We find that Nup62 proteins form a dynamic cross-channel meshwork impermeable to HBV capsids when grafted on the interior of 60-nm wide nanopores but not in 79-nm pores, where Nup62 cluster locally. Furthermore, importing substantially changes the dynamics of Nup62 assemblies and facilitates the passage of HBV capsids through NPC mimics containing Nup62 and Nup153. Our study shows the transport channel width is critical to the permeability of nup barriers and underscores the role of NTRs in dynamically remodeling nup assemblies and mediating the nuclear entry of viruses.

SUMMARY DNA nanotechnology provides a versatile and powerful tool to dissect the structure-function relationship of biomolecular machines like the nuclear pore complex (NPC), an enormous protein assembly that controls molecular traffic between the nucleus and cytoplasm. To understand how the intrinsically disordered, Phe-Gly-rich nucleoporins (FG-nups) within the NPC’s central transport channel impede the diffusion of macromolecules, we built a DNA-origami NanoTrap. The NanoTrap comprises precisely arranged FG-nups in an NPC-like channel, which sits on a baseplate that captures macromolecules that pass through the FG network. Using this biomimetic construct, we determined that the FG-motif type, grafting density and spatial arrangement are critical determinants of an effective diffusion barrier. Further, we observe that diffusion barriers formed with cohesive FG-interactions dominate in mixed-FG-nup scenarios. Our DNA-origami platform thus sheds light on how NPCs sieve inert macromolecules and will provide a valuable tool for studying nuclear transport.