A bstract Wolbachia are widespread maternally-inherited bacteria suggested to play a role in arthropod host speciation through induction of cytoplasmic incompatibility, but this hypothesis remains controversial. Most studies addressing Wolbachia -induced incompatibilities concern closely-related populations, which are intrinsically compatible. Here, we used three populations of two genetically differentiated colour forms of the haplodiploid spider mite Tetranychus urticae to dissect the interaction between Wolbachia -induced and host-associated incompatibilities, and to assess their relative contribution to post-mating isolation. We found that these two sources of incompatibility act through different mechanisms in an additive fashion. Host-associated incompatibility contributes 1.5 times more than Wolbachia -induced incompatibility in reducing hybrid production, the former through an overproduction of haploid sons at the expense of diploid daugters ( ca . 75% decrease) and the latter by increasing the embryonic mortality of daughters (by ca . 49%). Furthermore, regardless of cross direction, we observed near-complete F1 hybrid sterility and complete F2 hybrid breakdown between populations of the two forms, but that Wolbachia did not contribute to this outcome. This study identifies the mechanistic independence and additive nature of host-intrinsic and Wolbachia -induced sources of isolation. It suggests that Wolbachia could drive reproductive isolation in this system, thereby potentially affecting host differentiation and distribution in the field.

Abstract Endosymbiotic reproductive manipulators are widely studied as sources of post-zygotic isolation in arthropods, but their effect on pre-zygotic isolation between genetically differentiated populations has garnered less attention. We tested this using two partially isolated populations of the red and green colour forms of Tetranychus urticae , either uninfected or infected with a Wolbachia strain inducing or not cytoplasmic incompatibility. We first investigated male and female preferences, and found that, in absence of infection, females were not choosy but all males preferred red-form females. Wolbachia effects were more subtle, with only the CI-inducing strain slightly strengthening colour-form based preferences. We then performed a double-mating experiment to test how incompatible matings affect subsequent mating behaviour and offspring production, as compared to compatible mating. Females mated with an incompatible male (infected and/or heterotypic) were more attractive and/or receptive to subsequent (compatible) matings, although analyses of offspring production revealed no clear benefit for this remating behaviour ( i.e. , apparently unaltered first male sperm precedence). Finally, by computing the relative contributions of each reproductive barrier to total isolation, we showed that pre-mating isolation matches both host-associated and Wolbachia -induced post-mating isolation, suggesting that Wolbachia could assist speciation processes in this system.

In the last decades, many studies had revealed the potential role of arthropod bacterial endosymbionts in shaping the host range of generalist herbivores and their performance on different host plants, which, in turn, might affect endosymbiont distribution in herbivores populations. We tested this by measuring the prevalence of endosymbionts in natural populations of the generalist spider mite Tetranychus urticae on different host plants. Focusing on Wolbachia, we then analysed how symbionts affected mite life-history traits on the same host-plants in the laboratory. Overall, the prevalences of Cardinium and Rickettsia were low, whereas that of Wolbachia was high, with the highest values on bean and eggplant and the lowest on purple, tomato and zuchini. Although most mite life-history traits were affected by the plant species only, Wolbachia infection was detrimental for egg hatching rate on purple and zucchini, and led to a more female-biased sex ratio on purple and eggplant. These results suggest that endosymbionts may affect the host range of polyphagous herbivores, both by aiding and hampering their performance, depending on the host plant and on the life-history trait that affects performance the most. Conversely, endosymbiont spread may be facilitated or hindered by the plants on which infected herbivores occur.

Spider mites are severe pests of several annual and perennial crops worldwide, often causing important economic damages. Moreover, rapid evolution of pesticide resistance in this group hampers the efficiency of chemical control. Alternative control strategies, such as the use of entomopathogenic fungi, are thus being developed. However, while several studies have focussed on the evaluation of the control potential of different fungal species and/or isolates as well as their compatibility with other control methods (e.g. predators or chemical pesticides), knowledge on the extent of inter- and intraspecific variation in spider mite susceptibility to fungal infection is as yet incipient. Here, we measured the mortality induced by two generalist fungi, Beauveria bassiana and Metarhizium brunneum, in 12 spider mite populations belonging to different Tetranychus species: T. evansi, T. ludeni, the green form of T. urticae and the red form of T. urticae, within a full factorial experiment. We found that spider mite species differed in their susceptibility to infection to both fungal species. Moreover, we also found important intraspecific variation for this trait. These results draw caution on the development of single strains as biocontrol agents. Indeed, the high level of intraspecific variation suggests that (a) the one-size-fits-all strategy will probably fail to control spider-mite populations and (b) hosts resistance to infection may evolve at a rapid pace. Finally, we propose future directions to better understand this system and improve the long-term success of spider mite control strategies based on entomopathogenic fungi.

To fight infection, arthropods rely on the deployment of an innate immune response but also upon physical/chemical barriers and avoidance behaviours. However, most studies focus on immunity, with other defensive mechanisms being relatively overlooked. We have previously shown that the spider mite Tetranychus urticae does not mount an induced immune response towards systemic bacterial infections, entailing very high mortality rates. Therefore, we hypothesized that other defence mechanisms may be operating to minimize infection risk. Here, we test (a) if spider mites are also highly susceptible to other infection routes (spraying and feeding), and (b) if they display avoidance behaviours towards infected food. Individuals sprayed with or fed on Escherichia coli or Pseudomonas putida survived less than the control, pointing to a deficient capacity of the gut epithelium, and possibly of the cuticle, to contain bacteria. Additionally, we found that spider mites prefer uninfected food to food contaminated with bacteria, a choice that probably does not rely on olfactory cues. Our results suggest that spider mites may rely mostly on avoidance behaviours to minimize bacterial infection and highlight the multi-layered nature of immune strategies present in arthropods.

Many studies have revealed the ability of the endosymbiotic bacteria Wolbachia to protect its arthropod hosts against diverse pathogens. However, as Wolbachia may also increase the susceptibility of its host to infection, predicting the outcome of a particular Wolbachia-host-pathogen interaction remains elusive. Yet, understanding such interactions is crucial for disease and pest control strategies. Tetranychus urticae spider mites are herbivorous crop pests, causing severe damage on numerous economically important crops. Due to the rapid evolution of pesticide resistance, biological control strategies using generalist entomopathogenic are being developed. However, although spider mites are infected with various Wolbachia strains worldwide, whether this endosymbiont protects them from fungi is as yet unknown. Here, we compared the survival of two populations, treated with antibiotics or harbouring different Wolbachia strains, after exposure to the fungal biocontrol agents Metarhizium brunneum and Beauveria bassiana. In one population, Wolbachia affected survival in absence of fungi but not in their presence, whereas in the other population Wolbachia increased the mortality induced by B. bassiana. To control for potential effects of the bacterial community of spider mites, we also compared the susceptibility of two populations naturally uninfected by Wolbachia, treated with antibiotics or not. The antibiotic treatment increased the susceptibility of spider mites to M. brunneum in one naturally Wolbachia-uninfected population, but it had no effect in the other treatments. These results highlight the complexity of within-host pathogens interactions, and the importance of considering the whole bacterial community of arthropods when assessing the effect of Wolbachia in a particular system.

Laboratory studies are often criticized for not being representative of processes occurring in natural populations. This can be partially mitigated by using lab populations that capture large amounts of variation. Additionally, many studies addressing adaptation of organisms to their environment are done with laboratory populations, using quantitative genetics or experimental evolution methodologies. Such studies rely on populations that are either highly outbred or inbred. However, the methodology underlying the generation of such biological resources are usually not explicitly documented. Given their small size, short generation time, amenability to laboratory experimentation and knowledge of their ecological interactions, haplodiploid spider mites are becoming a widely used model organism. Here, we describe the creation of outbred populations of two species of spider mites, Tetranychus urticae and T. evansi, obtained by performing controlled crosses between individuals from field-collected populations. Subsequently, from the outbred population of T. evansi, we derived inbred lines, by performing several generations of sib-mating. These can be used to measure broad-sense heritability as well as correlations among traits. Finally, we outline an experimental evolution protocol that can be widely used in other systems. Sharing these biological resources with other laboratories and combining them with the available powerful genetic tools for T. urticae (and other species) will allow consistent and comparable studies that greatly contribute to our understanding of ecological and evolutionary processes.

Arthropods are often infected with Wolbachia inducing cytoplasmic incompatibility (CI), whereby crosses between uninfected females and infected males yield unviable fertilized offspring. Although uninfected females benefit from avoiding mating with Wolbachia-infected males, this behaviour is not present in all host species. Here we measured the prevalence of this behaviour across populations of the spider mite Tetranychus urticae. Females from five populations originally fully infected with Wolbachia showed no preference, possibly because they did not face the choice between compatible and incompatible mates in their environment. Hence, to determine whether this behaviour could be selected in populations with intermediate Wolbachia infection frequency, we performed 15 generations of experimental evolution of spider-mite populations under i) full Wolbachia infection, ii) no infection, or iii) mixed infection. In the latter selection regime, where uninfected females were exposed to infected and uninfected males at every generation, mating duration increased relative to the uninfected regime, suggesting the presence of genetic variation for mating traits. However, mate choice did not evolve. Together, these results show that CI-inducing Wolbachia alone does not necessarily lead to the evolution of pre-copulatory strategies in uninfected hosts, even at intermediate infection frequency.

Abstract Adaptation to abiotic stresses is pervasive and generally relies on traits that are not independent from those affecting species interactions. Still, how such evolution affects species coexistence remains elusive. We addressed this using populations of two herbivorous spider mite species ( Tetranychus urticae and T. evansi ) evolving separately on tomato plants hyper-accumulating cadmium, a stressful environment for the mites, or on control plants with no cadmium. Combinations of phenotypic analyses with structural stability theory predicted that adaptation of both species to cadmium allow them to coexist in that environment, whereas in cadmium-naïve mite populations the most likely outcome is exclusion. The shift from competitive exclusion to coexistence was due to an increase in niche differences accompanied by a decrease in fitness differences. A parallel population experiment validated these predictions. However, such changes were environment-specific, as spider-mite adaptation to cadmium did not affect species interactions and competitive outcomes in the cadmium-free environment. Our results suggest that evolution of single species in a new environment, even in absence of interspecific competitors, shapes species coexistence. Therefore, population shifts to novel environments may have unforeseen evolutionary consequences for community composition and the maintenance of species diversity.

Competition for food and negative interspecific sexual interactions (reproductive interference) have been identified as major drivers of species exclusion. These interactions likely do not act independently, as they often involve the same actors and may be modulated by the same underlying traits. However, how they determine competitive dominance when acting in combination has not yet been studied. Here, we address this issue using two closely related species, the spider mites Tetranychus urticae and T. cinnabarinus. First, by measuring species interactions in small-scale experiments, we revealed that the strength and symmetry of reproductive interference between species changed in presence of food competition. Next, using a population model, we showed that such non-additive effects induce significant changes in predicted competitive outcomes, specifically, a change in priority effects from favouring the inferior competitor for food in the sole presence of reproductive interference to favouring the superior competitor instead. Finally, we confirmed the accuracy of the model predictions for short-term population dynamics in a large-scale experiment. Together, these lines of evidence show that food competition and reproductive interference have non-additive rather than independent effects on the population dynamics of interacting species, which highlights the necessity of incorporating both mechanisms to better predict competitive outcomes.