Nucleic acid detection by isothermal amplification and the collateral cleavage of reporter molecules by CRISPR-associated enzymes is a promising alternative to quantitative PCR. Here, we report the clinical validation of the specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking (SHERLOCK) assay using the enzyme Cas13a from Leptotrichia wadei for the detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)—the virus that causes coronavirus disease 2019 (COVID-19)—in 154 nasopharyngeal and throat swab samples collected at Siriraj Hospital, Thailand. Within a detection limit of 42 RNA copies per reaction, SHERLOCK was 100% specific and 100% sensitive with a fluorescence readout, and 100% specific and 97% sensitive with a lateral-flow readout. For the full range of viral load in the clinical samples, the fluorescence readout was 100% specific and 96% sensitive. For 380 SARS-CoV-2-negative pre-operative samples from patients undergoing surgery, SHERLOCK was in 100% agreement with quantitative PCR with reverse transcription. The assay, which we show is amenable to multiplexed detection in a single lateral-flow strip incorporating an internal control for ribonuclease contamination, should facilitate SARS-CoV-2 detection in settings with limited resources. The specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking (SHERLOCK) assay detected severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA with high sensitivity and specificity in hundreds of nasopharyngeal and throat swab samples collected at Siriraj Hospital in Thailand.

Nature uses 64 codons to encode the synthesis of proteins from the genome, and chooses 1 sense codon-out of up to 6 synonyms-to encode each amino acid. Synonymous codon choice has diverse and important roles, and many synonymous substitutions are detrimental. Here we demonstrate that the number of codons used to encode the canonical amino acids can be reduced, through the genome-wide substitution of target codons by defined synonyms. We create a variant of Escherichia coli with a four-megabase synthetic genome through a high-fidelity convergent total synthesis. Our synthetic genome implements a defined recoding and refactoring scheme-with simple corrections at just seven positions-to replace every known occurrence of two sense codons and a stop codon in the genome. Thus, we recode 18,214 codons to create an organism with a 61-codon genome; this organism uses 59 codons to encode the 20 amino acids, and enables the deletion of a previously essential transfer RNA.

Bring your own copper: Copper-chelating azides undergo much faster click reactions (CuAAC) than nonchelating azides under a variety of biocompatible conditions. This kinetic enhancement allows site-specific protein labeling to be performed on the surface of living cells with only 10–40 μM CuI/CuII (see scheme). Detection sensitivity was also increased for CuAAC detection of alkyne-modified proteins and RNA.

Biological microscopy would benefit from smaller alternatives to green fluorescent protein for imaging specific proteins in living cells. Here we introduce PRIME (PRobe Incorporation Mediated by Enzymes), a method for fluorescent labeling of peptide-fused recombinant proteins in living cells with high specificity. PRIME uses an engineered fluorophore ligase, which is derived from the natural Escherichia coli enzyme lipoic acid ligase (LplA). Through structure-guided mutagenesis, we created a mutant ligase capable of recognizing a 7-hydroxycoumarin substrate and catalyzing its covalent conjugation to a transposable 13-amino acid peptide called LAP (LplA Acceptor Peptide). We showed that this fluorophore ligation occurs in cells in 10 min and that it is highly specific for LAP fusion proteins over all endogenous mammalian proteins. By genetically targeting the PRIME ligase to specific subcellular compartments, we were able to selectively label spatially distinct subsets of proteins, such as the surface pool of neurexin and the nuclear pool of actin.

The efficient, site-specific introduction of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells is an outstanding challenge in realizing the potential of genetic code expansion approaches. Addressing this challenge will allow the synthesis of modified recombinant proteins and augment emerging strategies that introduce new chemical functionalities into proteins to control and image their function with high spatial and temporal precision in cells. The efficiency of unnatural amino acid incorporation in response to the amber stop codon (UAG) in mammalian cells is commonly considered to be low. Here we demonstrate that tRNA levels can be limiting for unnatural amino acid incorporation efficiency, and we develop an optimized pyrrolysyl-tRNA synthetase/tRNACUA expression system, with optimized tRNA expression for mammalian cells. In addition, we engineer eRF1, that normally terminates translation on all three stop codons, to provide a substantial increase in unnatural amino acid incorporation in response to the UAG codon without increasing readthrough of other stop codons. By combining the optimized pyrrolysyl-tRNA synthetase/tRNACUA expression system and an engineered eRF1, we increase the yield of protein bearing unnatural amino acids at a single site 17- to 20-fold. Using the optimized system, we produce proteins containing unnatural amino acids with comparable yields to a protein produced from a gene that does not contain a UAG stop codon. Moreover, the optimized system increases the yield of protein, incorporating an unnatural amino acid at three sites, from unmeasurably low levels up to 43% of a no amber stop control. Our approach may enable the efficient production of site-specifically modified therapeutic proteins, and the quantitative replacement of targeted cellular proteins with versions bearing unnatural amino acids that allow imaging or synthetic regulation of protein function.

While thousands of previously unannotated small and alternative open reading frames (alt-ORFs) have recently been revealed in the human genome, the functions of only a handful are currently known, and no post-translational modifications of their polypeptide products have yet been reported, leaving open the question of their biological significance as a class. Using a proteomic strategy for discovery of unannotated short open reading frames in human cells, we report the detection of alt-RPL36, a 148-amino acid protein co-encoded with and overlapping human RPL36. Alt-RPL36 interacts with TMEM24, which transports the phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate [PI(4,5)P2] precursor phosphatidylinositol from the endoplasmic reticulum to the plasma membrane. Knock-out of alt-RPL36 in HEK 293T cells increased PI(4,5)P2 levels in the plasma membrane and upregulated the PI3K-AKT-mTOR signaling pathway. Remarkably, we find that four serine residues of alt-RPL36 are phosphorylated, and mutation of these four serines to alanine abolished the interaction with TMEM24 and regulation of PI3K signaling. These results implicate alt-RPL36 as a novel regulator of PI(4,5)P2 synthesis upstream of the PI3K-AKT-mTOR signaling pathway, and the first example of a phosphorylated alt-ORF product. More broadly, both alt-RPL36 and RPL36 regulate protein synthesis and cell growth via different molecular mechanisms - PI3K signaling and ribosome composition, respectively. One human transcript can therefore express two sequence-independent polypeptides from overlapping ORFs that regulate the same processes via distinct mechanisms.

Abstract Proteome synthesis is profoundly influenced by subcellular stress. However, both the nature of spatiotemporally-restricted cues and the underpinning local responders mediating these cues remain elusive. Unlocking these mechanisms requires an ability to functionally map in living cells locale-specific stress responders and simultaneously interrogate how a localized cue on specific local players contextually impacts proteome synthesis in trans . Here we resolve this prime problem by integrating precision localized electrophile delivery and genetic-code-expansion-based translation reporter tools. Among the four distinct subcellular locales examined, nuclear-targeted stress most prominently inhibits protein translation. We discovered that NCBP1—a nuclear-resident protein with multifaceted roles in eukaryotic mRNA-biogenesis—propagates this nuclear stress signal through a single cysteine (C436) among the 19 conserved, affecting 200 alternative-splicing events across 119 genes differentially-expressed in response to nuclear stress. Global protein-synthesis stall was choreographed by electrophile-labeled NCBP1(C436) triggering the production of alternatively-spliced S6-kinase, which we found to dominantly suppress protein translation.

Epidermal growth factor receptor (EGFR) activation by growth factors (GFs) relies on dimerization and allosteric activation of its intrinsic kinase activity, resulting in transphosphorylation of tyrosines on its Cterminal tail. While structural and biochemical studies identified this EGF induced allosteric activation, imaging collective EGFR activation in cells and molecular dynamics simulations pointed at additional catalytic EGFR activation mechanisms. To gain more insight in EGFR activation mechanisms in living cells, we developed a Forster Resonance Energy Transfer (FRET) based conformational EGFR indicator (CONEGI) using genetic code expansion that reports on conformational transitions in the EGFR activation loop. Comparing conformational transitions, selfassociation and autophosphorylation of CONEGI and its Y845F mutant revealed that Y845 phosphorylation induces a catalytically active conformation in EGFR monomers. This conformational transition depends on EGFR kinase activity and auto-phosphorylation on its Cterminal tail, generating a looped causality that leads to autocatalytic amplification of EGFR phosphorylation at low EGF dose.