Elucidation of endogenous cellular protein-protein interactions and their networks is most desirable for biological studies. Here we report our study of endogenous human coregulator protein complex networks obtained from integrative mass spectrometry-based analysis of 3290 affinity purifications. By preserving weak protein interactions during complex isolation and utilizing high levels of reciprocity in the large dataset, we identified many unreported protein associations, such as a transcriptional network formed by ZMYND8, ZNF687, and ZNF592. Furthermore, our work revealed a tiered interplay within networks that share common proteins, providing a conceptual organization of a cellular proteome composed of minimal endogenous modules (MEMOs), complex isoforms (uniCOREs), and regulatory complex-complex interaction networks (CCIs). This resource will effectively fill a void in linking correlative genomic studies with an understanding of transcriptional regulatory protein functions within the proteome for formulation and testing of future hypotheses.

Abstract BACKGROUND Targeted treatment options are desperately needed for ependymomas (EPN). Chimeric antigen receptor (CAR) T-cells have immense potential to positively transform treatment outcomes; however, little is known regarding antitumor efficacy of CAR T-cells against EPNs. Specifically, antigen density has emerged as a major influencer of CAR T-cell potency. However, the specific high and low antigen density thresholds governing CAR T-cell efficacy for EPN are unknown. We hypothesize that antigen density heterogeneity governs CAR T-cell potency against EPN. METHODS Using quantitative flow cytometry, we determined antigen density of B7-H3 and HER2 (the two CAR targets currently in pediatric EPN clinical trials) on EPN patient derived cell lines (1425, ST1, CPITT, ST2, EPI, L46SJ). We generated second generation B7-H3 and HER2-CAR T-cells with CD28z signaling domain and compared long-term cytolytic activity, expansion, and cytokine production against EPNs. RESULTS We found that all EPN cell lines express remarkably high yet variable density of B7-H3 (6.3e4 – 3.4e5 molecules/ cell). In contrast, surface density of HER2 was consistently and significantly lower (860 – 2.5e4 molecules/ cell). In repeated-stimulation assays, B7-H3-CAR T-cells killed 7-10 times and expanded up to 325,360-fold when cultured against EPN. However, we observed no significant difference in total expansion or correlation with antigen density against EPNs. Surprisingly, expansion of HER2-CAR T-cells against EPNs was drastically higher (up to over 100-billion-fold) and greatly exceeded that of B7-H3-CAR-T cells against the same EPN cells despite much lower antigen density. CONCLUSIONS Our studies reveal significant antigen density heterogeneity of B7-H3 and HER2 in EPN, which may lead to target-specific impacts on CAR T-cell persistence. Indeed, results suggest that lower antigen density of HER2 may be superior for sustained CAR T-cell activity. Future work will validate whether HER-CAR T-cells have superior antitumor efficacy in vivo to further delineate role of antigen density thresholds in CAR T-cell potency.

Abstract BACKGROUND The infiltrative growth patterns and restrictiveness of the blood brain barrier greatly limit therapeutic options for children diagnosed with diffuse intrinsic pontine gliomas (DIPGs). However, clinical trials using chimeric antigen receptor (CAR)-T cells have shown promise in DIPG patients. Despite some success, the biological limitations plaguing CAR-T cells hinder their overall efficacy. We propose that leveraging chemical compounds in tandem with CAR-T cells may provide an increased therapeutic benefit against this lethal brain tumor. Our study is aimed at using high throughput screening of >2,000 FDA approved and investigational compounds to identify candidates that enhance CAR-T cell mediated cytotoxicity of DIPGs. METHODS In an initial limited screen (32 compounds) used for optimization, compounds were serially diluted using the Echo 650 acoustic liquid handler. Subsequent co-culture conditions of renilla luciferase transduced DIPG007 tumor cells and clinically relevant firefly luciferase transduced CAR-T cells were plated at a 2:1 effector: target (E: T) ratio. In comparison to DMSO control, drug induced changes on cell viability were measured using cell-specific luciferase activity at 24 and 72 hours. RESULTS The limited screen revealed the BET bromodomain inhibitor, GSK-046, as an initial target based on its ability to increase CAR-T cell viability after 72 hours. Preliminary validation of these findings supports this CAR-T enhancing role of GSK-046 via MTS assays. We also identified nonlethal concentrations of GSK-046 for DIPG007 cells that could be further tested in combination with CAR-T cells to determine therapeutic synergy. CONCLUSIONS Our initial findings warrant further investigation into the combinatorial benefit of GSK-046 and CAR-T cells against DIPGs. Currently, we are optimizing and expanding our drug screen to identify additional compounds that may complement CAR-T cell therapy. Furthermore, we intend to validate the cytotoxic benefit of our prioritized combinations in additional in vitro and in vivo settings.

ABSTRACT T cell exhaustion is linked to persistent antigen exposure and perturbed activation events, correlating with poor disease prognosis. Tumor-mediated T cell exhaustion is well documented; however, how the nutrient-deprived tumor niche affects T cell receptor (TCR) activation is largely unclear. We show that methionine metabolism licenses optimal TCR signaling by regulating the protein arginine methylome, and limiting methionine availability during early TCR signaling promotes subsequent T cell exhaustion. We discovered a novel arginine methylation of a Ca 2+ -activated potassium transporter, KCa3.1, prevention of which results in increased Ca 2+ -mediated NFAT1 activation, NFAT1 promoter occupancy, and T cell exhaustion. Furthermore, methionine supplementation reduces nuclear NFAT1 in tumor-infiltrating T cells and augments their anti-tumor activity. These findings demonstrate metabolic regulation of T cell exhaustion determined during TCR engagement.

Introductory Paragraph Chimeric antigen receptor (CAR) technologies have been clinically implemented for the treatment of hematological malignancies; however, solid tumors remain resilient to CAR therapeutics 1-3 . Natural Killer (NK) cells may provide an optimal class of immune cells for CAR-based approaches due to their inherent anti-tumor functionality. We sought to tune CAR synapses in NK cells by adding an intracellular scaffolding protein binding site to the CAR. We employed a PDZ binding motif (PDZbm) that specifically binds Scribble 4 resulting in additional scaffolding crosslinking to enhance synapse formation and cell polarization 5,6 . Combined effects of this novel CAR design resulted in increased effector cell functionality in vitro and in vivo . Synapse-tuned CAR-NK cells exhibited amplified synaptic strength, number and abundance of secreted cytokines, enhanced killing of tumor cells, and prolonged survival with tumor clearance in two solid tumor models. Thus, synapse tuning has the potential to improve the efficacy of CAR-based cell therapeutics.