Abstract The FtsN protein of Escherichia coli and other proteobacteria is an essential and highly conserved bitopic membrane protein that triggers the inward synthesis of septal peptidoglycan (sPG) during cell division. Previous work has shown that the activation of sPG synthesis by FtsN involves a series of interactions of FtsN with other divisome proteins and the cell wall. Precisely how FtsN achieves this role is unclear, but a recent study has shown that FtsN promotes the relocation of the essential sPG synthase FtsWI from an FtsZ-associated track (where FtsWI is inactive) to an sPG-track (where FtsWI engages in sPG synthesis). Whether FtsN works by displacing FtsWI from the Z-track or capturing/retaining FtsWI on the sPG-track is not known. Here we use single-molecule imaging and genetic manipulation to investigate the organization and dynamics of FtsN at the septum and how they are coupled to sPG synthesis activity. We found that FtsN exhibits a spatial organization and dynamics distinct from those of the FtsZ-ring. Single FtsN molecules move processively as a single population with a speed of ∼ 9 nm s -1 , similar to the speed of active FtsWI molecules on the sPG-track, but significantly different from the ∼ 30 nm s -1 speed of inactive FtsWI molecules on the FtsZ-track. Furthermore, the processive movement of FtsN is independent of FtsZ’s treadmilling dynamics but driven exclusively by active sPG synthesis. Importantly, only the essential domain of FtsN, a three-helix bundle in the periplasm, is required to maintain the processive complex containing both FtsWI and FtsN on the sPG-track. We conclude that FtsN activates sPG synthesis by forming a processive synthesis complex with FtsWI exclusively on the sPG-track. These findings favor a model in which FtsN captures or retains FtsWI on the sPG-track rather than one in which FtsN actively displaces FtsWI from the Z-track.

ABSTRACT The bacterial divisome, a macromolecular machine that is composed of more than thirty proteins in E. coli , orchestrates the essential process of cell wall constriction during cell division. Novel antimicrobial strategies can target protein-protein interactions within the divisome and will benefit from insights into divisome structure and dynamics. In this work, we combined structure prediction, molecular dynamics simulation, single-molecule imaging, and mutagenesis to construct a model of the core complex of the E. coli divisome composed of the essential septal cell wall synthase complex formed by FtsW and FtsI, and its regulators FtsQ, FtsL, FtsB, and FtsN. We observed extensive interactions in four key regions in the periplasmic domains of the complex. FtsQ, FtsL, and FtsB scaffold FtsI in an extended conformation with the FtsI transpeptidase domain lifted away from the membrane through interactions among the C-terminal domains. FtsN binds between FtsI and FtsL in a region rich in residues with superfission (activating) and dominant negative (inhibitory) mutations. Mutagenesis experiments in cellulo and in silico revealed that the essential domain of FtsN functions as a tether to tie FtsI and FtsL together, impacting interactions between the anchor-loop of FtsI and the putative catalytic region of FtsW, suggesting a mechanism of how FtsN activates the cell wall synthesis activities of FtsW and FtsI.

ABSTRACT To divide, bacteria must synthesize and remodel their peptidoglycan (PG) cell wall, a protective meshwork that maintains cell shape. FtsZ, a tubulin homolog, dynamically assembles into a midcell band, recruiting division proteins including the PG synthases FtsW and FtsI. FtsWI are activated to synthesize PG and drive constriction at the appropriate time and place, however their activation pathway remains unresolved. In Caulobacter crescentus , FtsWI activity requires FzlA, an essential FtsZ-binding protein. Through time-lapse imaging and single-molecule tracking of C. crescentus FtsW and FzlA in perturbed genetic backgrounds, we demonstrate that FzlA is a limiting constriction activation factor that converts inactive, fast-moving FtsW to an active, slow-moving state. We find that FzlA interacts with the DNA translocase FtsK, and place FtsK genetically in a pathway with FzlA and FtsWI. Misregulation of the FzlA-FtsK-FtsWI pathway leads to heightened DNA damage and cell death. We propose that FzlA integrates the FtsZ ring, chromosome segregation, and PG synthesis to ensure robust and timely constriction during Caulobacter division.

Abstract Most bacteria lack membrane-enclosed organelles to compartmentalize cellular processes. In lieu of physical compartments, bacterial proteins are often recruited to macromolecular scaffolds at specific subcellular locations to carry out their functions. Consequently, the ability to modulate a protein’s subcellular location with high precision and speed bears the potential to manipulate its corresponding cellular functions. Here we demonstrate that the CRY2/CIB1 system from Arabidopsis thaliana can be used to rapidly direct proteins to different subcellular locations inside live E. coli cells including the nucleoid, the cell pole, membrane, and the midcell division plane. We further show that such light-induced re-localization can be used to rapidly inhibit cytokinesis in actively dividing E. coli cells. Finally, we demonstrate that the CRY2/CIBN binding kinetics can be modulated by green light, adding a new dimension of control to the system.

Abstract The E. coli cell division protein FtsN was proposed to coordinate septal peptidoglycan (sPG) synthesis and degradation to ensure robust cell wall constriction without lethal lesions. Although the precise mechanism remains unclear, previous work highlights the importance of two FtsN domains: the E domain, which interacts with and activates the sPG synthesis complex FtsWIQLB, and the SPOR domain, which binds to denuded glycan (dnG) strands, key intermediates in sPG degradation. Here, we used single-molecule tracking of FtsN and FtsW (a proxy for the sPG synthesis complex FtsWIQLB) to investigate how FtsN coordinates the two opposing processes. We observed dynamic behaviors indicating that FtsN’s SPOR domain binds to dnGs cooperatively, which both sequesters the sPG synthesis complex on dnG (termed as the dnG-track) and protects dnGs from degradation by lytic transglycosylases (LTs). The release of the SPOR domain from dnGs leads to activating the sPG synthesis complex on the sPG-track and simultaneously exposing those same dnGs to degradation. Furthermore, FtsN’s SPOR domain self-interacts and facilitates the formation of a multimeric sPG synthesis complex on both tracks. The cooperative self-interaction of the SPOR domain creates a sensitive switch to regulate the partitioning of FtsN between the dnG- and sPG-tracks, thereby controlling the balance between sequestered and active populations of the sPG synthesis complex. As such, FtsN coordinates sPG synthesis and degradation in space and time.

During bacterial cell division, synthesis of new septal peptidoglycan (sPG) is crucial for successful cytokinesis and cell pole morphogenesis. FtsW, a SEDS (Shape, Elongation, Division and Sporulation) family protein and an indispensable component of the cell division machinery in all walled bacterial species, was recently identified in vitro as a new monofunctional peptidoglycan glycosyltransferases (PGTase). FtsW and its cognate monofunctional transpeptidase (TPase) class b penicillin binding protein (PBP3 or FtsI in E. coli) may constitute the essential, bifunctional sPG synthase specific for new sPG synthesis. Despite its importance, the septal PGTase activity of FtsW has not been documented in vivo. How its activity is spatiotemporally regulated in vivo has also remained unknown. Here we investigated the septal PGTase activity and dynamics of FtsW in E. coli cells using a combination of single-molecule imaging and genetic manipulations. We showed that FtsW exhibited robust activity to incorporate an N-acetylmuramic acid analog at septa in the absence of other known PGTases, confirming FtsW as the essential septum-specific PGTase in vivo. Furthermore, we identified two populations of processively moving FtsW molecules at septa. A fast-moving population is driven by the treadmilling dynamics of FtsZ and independent of sPG synthesis. A slow-moving population is driven by active sPG synthesis and independent of FtsZ treadmilling dynamics. We further identified that FtsN, a potential sPG synthesis activator, plays an important role in promoting the slow-moving, sPG synthesis-dependent population. Our results support a two-track model, in which inactive sPG synthase molecules follow the fast treadmilling 'Z-track' to be distributed along the septum; FtsN promotes their release from the 'Z-track' to become active in sPG synthesis on the slow 'sPG-track'. This model integrates spatial information into the regulation of sPG synthesis activity and could serve as a mechanism for the spatiotemporal coordination of bacterial cell wall constriction.

FtsZ, a highly conserved bacterial tubulin GTPase homolog, is a central component of the cell division machinery in nearly all walled bacteria. FtsZ polymerizes at the future division site and recruits > 30 proteins that assemble into a macromolecular complex termed divisome. Many of these divisome proteins are involved in septal cell wall peptidoglycan (sPG) synthesis. Recent studies found that FtsZ polymers undergo GTP hydrolysis-coupled treadmilling dynamics along the septum circumference of dividing cells, which drives processive movements of sPG synthesis enzymes. The mechanism of FtsZ treadmilling-driven directional transport of sPG enzymes and its precise role in bacterial cell division are unknown. Combining theoretical modeling and experimental testing, we show that FtsZ treadmilling drives the directional movement of sPG-synthesis enzymes via a Brownian ratchet mechanism, where the shrinking end of FtsZ polymers introduces an asymmetry to rectify diffusion of single enzyme molecules into persistent end-tracking movement. Furthermore, we show that processivity of this directional movement hinges on the balance between the enzyme's diffusion and FtsZ's treadmilling speed, which provides a mechanism to control the level of available enzymes for active sPG synthesis, explaining the distinct roles of FtsZ treadmilling in modulating cell wall constriction rate observed in different bacterial species.