Summary Agro‐infiltration of leaf tissue with binary vectors harbouring a sequence of interest is a rapid method of expressing proteins in plants. It has recently been shown that flanking the sequence to be expressed with a modified 5′‐untranslated region (UTR) and the 3′‐UTR from Cowpea mosaic virus (CPMV) RNA‐2 (CPMV‐ HT ) within the binary vector pBINPLUS greatly enhances the level of expression that can be achieved [ Sainsbury, F. and Lomonossoff, G.P. (2008) Plant Physiol . 148 , 1212–1218]. To exploit this finding, a series of small binary vectors tailored for transient expression (termed the pEAQ vectors) has been created. In these, more than 7 kb of non‐essential sequence was removed from the pBINPLUS backbone and T‐DNA region, and unique restriction sites were introduced to allow for accommodation of multiple expression cassettes, including that for a suppressor of silencing, on the same plasmid. These vectors allow the high‐level simultaneous expression of multiple polypeptides from a single plasmid within a few days. Furthermore, vectors have been developed which allow the direct cloning of genes into the binary plasmid by both restriction enzyme‐based cloning and GATEWAY recombination. In both cases, N‐ or C‐terminal histidine tags may be fused to the target sequence as required. These vectors provide an easy and quick tool for the production of milligram quantities of recombinant proteins from plants with standard plant research techniques at a bench‐top scale.

Oligonucleotide primers have been used to generate a cDNA library covering the entire tobacco mosaic virus (TMV) RNA sequence. Analysis of these clones has enabled us to complete the viral RNA sequence and to study its variability within a viral population. The positive strand coding sequence starts 69 nucleotides from the 5' end with a reading frame for a protein of Mr 125,941 and terminates with UAG. Readthrough of this terminator would give rise to a protein of Mr 183,253. Overlapping the terminal five codons of this readthrough reading frame is a second reading frame coding for a protein of Mr 29,987. This gene terminates two nucleotides before the initiator codon of the coat protein gene. Potential signal sequences responsible for the capping and synthesis of the coat protein and Mr 29,987 protein mRNAs have been identified. Similar sequences within these reading frames may be used in the expression of sets of proteins that share COOH-terminal sequences.

The substrate specificity of micrococcal nuclease (EC 3.1.4.7.) has been studied. The enzyme recognises features of nucleotide composition, nucleotide sequence and tertiary structure of DNA. Kinetic analysis indicates that the rate of cleavage is 30 times greater at the 5' side of A or T than at G or C. Digestion of end-labelled linear DNA molecules of known sequence revealed that only a limited number of sites are cut, generating a highly specific pattern of fragments. The frequency of cleavage at each site has been determined and it may reflect the poor base overlap in the 5' T-A 3' stack as well as the length of contiguous A and T residues. The same sequence preferences are found when DNA is assembled into nucleosomes. Deoxyribonuclease 1 (EC 3.1.4.5.) recognises many of the same sequence features. Micrococcal nuclease also mimics nuclease S1 selectively cleaving an inverted repeat in supercoiled pBR322. The value of micrococcal nuclease as a "non-specific" enzymatic probe for studying nucleosome phasing is questioned.

Abstract Plant-based overexpression of heterologous proteins has attracted much interest and development in recent years. To date, the most efficient vectors have been based on RNA virus-derived replicons. A system based on a disabled version of cowpea mosaic virus RNA-2 has been developed, which overcomes limitations on insert size and introduces biocontainment. This system involves positioning a gene of interest between the 5′ leader sequence and 3′ untranslated region (UTR) of RNA-2, thereby emulating a presumably stable mRNA for efficient translation. Thus far, the sequence of the 5′ UTR has been preserved to maintain the ability of the modified RNA-2 to be replicated by RNA-1. However, high-level expression may be achieved in the absence of RNA-1-derived replication functions using Agrobacterium-mediated transient transformation. To investigate those features of the 5′ UTR necessary for efficient expression, we have addressed the role of two AUG codons found within the 5′ leader sequence upstream of the main initiation start site. Deletion of an in-frame start codon upstream of the main translation initiation site led to a massive increase in foreign protein accumulation. By 6 d postinfiltration, a number of unrelated proteins, including a full-size IgG and a self-assembling virus-like particle, were expressed to >10% and 20% of total extractable protein, respectively. Thus, this system provides an ideal vehicle for high-level expression that does not rely on viral replication of transcripts.

The importance of virus maturation has been appreciated for nearly 70 years as it provides models for large-scale protein reorganization resulting in functional activation as well as being a target for antiviral therapies. However, a detailed description of the pathway from the initial assembly product (procapsid) to the mature, infectious particle (virion) has been elusive. This is due to the "in cell" nature of the natural process, the 2-state behavior of maturation (no detectable intermediates) in some viruses in vitro and heterogeneous populations of particle intermediates that are only partially matured in other systems. The non-enveloped, T=4, ssRNA-containing, Nudaurelia capensis omega virus (NωV), is a highly accessible model system that exemplifies the maturation process of a eukaryotic virus. During maturation the particle shrinks in outer diameter from 482 Angstroms (pH 7.5) to 428 Angstroms (pH 5.0). It is possible to mimic the maturation process in vitro by lowering the pH of a population of procapsids produced in heterologous systems. Indeed, by controlling the pH in vitro it is possible to produce homogenous populations of intermediate NωV virus-like particles (VLPs) that occur too fleetingly to be observed in vivo. Here we report structural models, based on cryo-electron microscopy (cryo-EM), of five intermediates in the NωV maturation process. The structures of the intermediate particles reveal unique, quaternary position-dependent trajectories and refolding of subunit N and C-terminal regions, including the formation of the autocatalytic cleavage site at N570. The detailed structures reported here, coupled with previously determined structures of the procapsids and mature particles, allows the maturation pathway to be described in detail for the first time for a eukaryotic virus.

The Tier 1 select agent Burkholderia pseudomallei is the causative agent of melioidosis, a global pathogen and a major cause of pneumonia and sepsis for which no licensed vaccines currently exist. Previous work has shown the potential for Burkholderia capsular polysaccharide (CPS) to be used as a vaccine antigen but the T-cell independent nature of the immune response to this molecule requires the use of this polysaccharide as a glycoconjugate for vaccination. Recent studies have focussed on the use of Crm197 (a non-toxic mutant protein derived from diphtheria toxin) as the carrier but there are concerns regarding its potential to cause interference with other vaccines containing Crm197. Therefore research with alternative carrier proteins would be beneficial. In this study, CPS was isolated from the non-pathogenic B. thailandensis strain E555. This was chemically conjugated to Crm197, or Tandem CoreTM virus-like particles (TCVLP) consisting of hepatitis B core protein, which is the first documented use of VLPs in melioidosis vaccine development. Analysis of CPS-specific IgG antibody titres showed that mice vaccinated with the Crm197 conjugate generated significantly higher titres than the mice that received TCVLP-CPS but both conjugate vaccines were able to protect mice against intraperitoneal B. pseudomallei strain K96243 challenges of multiple median lethal doses.### Competing Interest Statement

Monoclonal antibodies have revolutionized therapies, but non-immunoglobulin scaffolds are becoming compelling alternatives owing to their adaptability. Their ability to be labeled with imaging or cytotoxic compounds and to create multimeric proteins is an attractive strategy for therapeutics. Focusing on HER2, a frequently overexpressed receptor in breast cancer, this study addresses some limitations of conventional targeting moieties by harnessing the potential of these scaffolds. HER2-binding Affimers were isolated and characterized, demonstrating potency as binding reagents and efficient internalization by HER2-overexpressing cells. Affimers conjugated with cytotoxic agent achieved dose-dependent reductions in cell viability within HER2-overexpressing cell lines. Bispecific Affimers, targeting HER2 and virus-like particles, facilitated efficient internalization of virus-like particles carrying enhanced green fluorescent protein (eGFP)-encoding RNA, leading to protein expression. Anti-HER2 affibody or designed ankyrin repeat protein (DARPin) fusion constructs with the anti-VLP Affimer further underscore the adaptability of this approach. This study demonstrates the versatility of scaffolds for precise delivery of cargos into cells, advancing biotechnology and therapeutic research.

Abstract Polioviruses have caused crippling disease in humans for centuries, prior to the successful development of vaccines in the mid-1900’s, which dramatically reduced disease prevalence. Continued use of these vaccines, however, threatens ultimate disease eradication and achievement of a polio-free world. Virus-like particles (VLPs) that lack a viral genome represent a safer potential vaccine, although they require particle stabilization. Using our previously established genetic techniques to stabilize the structural capsid proteins, we demonstrate production of poliovirus VLPs of all three serotypes, from four different recombinant expression systems. We compare the antigenicity, thermostability and immunogenicity of these stabilized VLPs against the current inactivated polio vaccine, demonstrating equivalent or superior immunogenicity. Structural analyses of these recombinant VLPs provide a rational understanding of the stabilizing mutations and the role of potential excipients. Collectively, we have established these poliovirus stabilized VLPs as viable next-generation vaccine candidates for the future.